Диссертация (1174186), страница 32
Текст из файла (страница 32)
Анализ кинетических кривых рибофлавина во ВПК свидетельствуют о том, что для повышения или уменьшенияуровняфотосенсибилизаторанеобязательноизменятьсодержаниедействующего вещества (рибофлавин). Этого можно добиться посредством199введения в состав раствора вспомогательных соединений, в частностиполимеров (Бикбов М.М. и соавт., 2013а, 2013б, 2013в), в т.ч. хитозанасукцината (Халимов А.Р., Бабушкин А.Э., 2009).
Практически во всехэкспериментах Риболинк, в меньшей степени растворы изоосмотическогорибофлавина и Хитолинка создавали высокие терапевтические концентрациифотосенсибилизатора в тканях глаза. При этом Риболинк в составе с ГПМЦобеспечивал устойчивый пролонгирующий эффект (в течение 30-60 мин).Вместе с тем препарат Декстралинк во все сроки наблюдения,независимо от диапазона деэпителизации роговицы, обеспечивал меньшуюконцентрацию фотосенсибилизатора в переднекамерной влаге по сравнению сизоосмотическим раствором рибофлавина, средствами Риболинк и Хитолинк.Это связано с обезвоживающим эффектом полимера декстран, которыйспособствует уплотнению стромы и снижению толщины роговицы, затрудняятранспорт гидрофильной фракции рибофлавина мононуклеотида. Lombardo M.с соавт.
также указывают на то, что раствор рибофлавина с декстраном посвоейспособностинасыщатьстромуроговицыфотосенсибилизаторомзначительно уступал гипоосмотическому водному рибофлавину (Lombardo M.et al., 2015а).Однако достаточное, на первый взгляд, содержание рибофлавина в ВПКили роговице не может гарантировать выполнение ее качественного ибезопасногоУФсшивания.Дляэффективногонасыщениястромырибофлавином должна быть достаточной площадь деэпителизации роговицы,которая по нашим исследованиям составляет не менее 8-9 мм.
Площадьудаленного эпителия роговицы образует в строме соответствующую поразмерам зону, пропитанную рибофлавином, которая на следующем этапекросслинкингаподвергаетсявоздействиюультрафиолетовогоизлучения(примерно на 8-10 мм диаметра оптической оболочки) (Бикбов М.М. и соавт.,2016а).Эффект метода коллагенового кросслинкинга определяется двумяфакторами: величиной минимальной толщины роговицы и степенью ее200насыщения рибофлавином (Hafezi F. et al., 2007). При этом повышениеконцентрации рибофлавина в роговице обратно пропорционально степенисвязывания волокон коллагена (Spoerl E. et al., 2008).Кроме того препараты Декстралинк, Риболинк и Хитолинк, очевидно,свойзащитныйэффектпоотношениюреализовывать дополнительнозакультрафиолетусчет образуемойприспособныинстилляцияхрибофлавиновой пленки на поверхности роговицы (Зайнуллина Н.Б.
и соавт.,2012; Халимов А.Р., 2017). Слой рибофлавина, образуемый на поверхностидеэпителизированнойроговицыприинстилляцияхрастворов,создаетсистему «роговица – рибофлавин – прекорнеальная пленка». Последняя приэтом, является неотъемлемой частью безопасности процедуры УФ сшиванияроговичного коллагена. Уже с первой минуты инстилляций прекорнеальнаяпленкавзависимостиотсоставафотосенсибилизатораспособнадополнительно поглощать от 29% (изоосмотический рибофлавин) до 53%(Декстралинк) энергии УФ излучения, что является одним из механизмовзащиты чувствительных клеток эндотелия и глублежащих структур глаза.Инстилляции исследуемых растворов показали, что через 30 мин, когда вусловиях выполнения CXL начинается этап УФ облучения, система«роговица – рибофлавин – прекорнеальная пленка» абсорбировала от 99,7%до100%мощностимногократнонижеиспользуемоготоксическогоультрафиолетапорогадля(3мВт/см 2),эндотелиальныхчтоклеток(Wollensak G.
et al., 2004в). Вместе с тем было показано, что проникновениеультрафиолета от центра к периферии роговицы уменьшается в среднем на20%. Это связано с рассеянием и поглощением УФ светового потока.Соответственнонаиболееуязвимаячастьэндотелиальныхклетокрасполагается в центральной зоне роговицы (Doutch J.J. et al., 2012).Изоосмотичный раствор рибофлавина (контроль) оказывал ультрафиолетовуюпротекциюзасчетфизиологическойинтракорнеальнойдиффузиидействующего вещества, создавая при этом неустойчивый поверхностныйслойфотосенсибилизатора,что,соответственно,требовалочастых201инстилляций препарата, тогда как препараты на полимерной основе – сдекстраном, хитозаном и ГПМЦ образовывали стабильную прекорнеальнуюпленку на поверхности роговицы, способствующую непрерывной пенетрациивитамина В2 в строму. Установлена оптимальная частота инстилляций дляисследованных растворов рибофлавина: для изоосмотического – 1 кап / 1 мин,для Декстралинк, Риболинк и Хитолинк – 1 кап / 2 мин (Бикбов М.М.
и соавт.,2015; Халимов А.Р., 2017). Актуальность суждения о защитном эффектепрекорнеальной пленки рибофлавина существенно возрастает в условияхприменения новых протоколов кросслинкинга, в частности, акселерированной(ускоренной) техники УФ сшивания, при которой сквозь слои роговицы вединицу времени проходит бóльшая мощность ультрафиолета.Таким образом, основным критерием эффективности процедуры УФкросслинкинга является повышение прочностных свойств роговицы, величинукоторых способна изменять гидратация стромы.
Стабильные биометрическиепараметры оптической оболочки, связанные с особенностями действияиспользуемых рибофлавинсодержащих растворов служат одним из условийбезопасностипроцедуры.Факторами,обеспечивающимиадекватнуюультрафиолетовую протекцию, являются оптимальное интрастромальноесодержаниерибофлавина,площадьдеэпителизациироговицы,составрастворов и частота их инстилляций, которые, в свою очередь, обуславливаютстабильность прекорнеальной пленки фотосенсибилизатора.6.2.Особенностимолекулярныхиклеточныхмеханизмовультрафиолетового сшивания роговицыИзвестно, что коллаген соединительной ткани организма и коллагенроговицы, в частности, являются хорошими мишенями для свободныхрадикалов кислорода (Monboisse J.C., Borel J.P., 1992).
Проведенные намиисследованиятакжепоказализначимуюрольпроцессовсвободно-радикального окисления в реализации механизмов УФ сшивания роговицы.Былоустановлено,чтоактивацияпроцессовсвободно-радикального202окисления после УФ облучения роговицы характеризуется существеннымростом основных параметров ЛЗ и ЖИ хемилюминесценции в тканях глазаэкспериментальных животных. Изменения значений ХЛ в исследуемыхгруппах с изоосмотическим раствором рибофлавина, средствами Декстралинк,Риболинк и Хитолинк после рибофлавин-УФ обработки были однотипными ине имели значимых отличий, что указывает на идентичные молекулярныемеханизмы, инициируемые ультрафиолетовым воздействием в присутствиифотосенсибилизатора.Исследованиялюминолзависимойхемилюминесценцииобразцовпереднекамерной влаги непосредственно после УФ облучения роговицкроликов без рибофлавина демонстрировали статистически значимое почтишестикратное увеличение основных параметров ХЛ– светосуммы испонтанной светимости, указывающее на значительное усиление процессовсвободно-радикального окисления, наблюдаемое в тканях глаза.
Наиболееинтенсивно процессы СРО протекают в первые часы после УФ воздействия сих дальнейшим постепенным (до 14 сут) ослаблением.Сравнение параметров ХЛ в образцах ВПК производили также после УФоблучения роговицы в присутствии фотосенсибилизатора. Установлено, чтоприкомбинированномУФсшиваниисрибофлавиномпроцессрадикалообразования отличается от такового при УФ облучении роговицы безФС.
Нами было обнаружено, что через 1 ч после процедуры значения ХЛдостоверно превышали норму только 3-кратно, а на 1-4 сут – уже в 4-5 раз,хотя к этому сроку логичнее было бы наблюдать нормализацию показателейЛЗ ХЛ, по отношению к значениям только что облученных животных. Этоможет быть связано с тем, что через 1 ч после начала УФ сшивания в ВПКглаза еще обнаруживаются некоторые количества рибофлавина, которыйоказывает антиоксидантный эффект, участвуя в метаболизме окислительновосстановительных процессов, угнетая свечение хемилюминесценции вмодельной системе in vitro.203Рибофлавин с высоковолновым (370 нм) УФ излучением опосредуетпроцесс сшивания фибрилл коллагена за счет активации процессов СРО.Вместе с тем, рибофлавин, поглощая энергию ультрафиолета, ослабляет егоактивность за счет обратимого восстановления путем присоединенияводорода по месту двойных связей. Это качество рибофлавина легковосстанавливаться и окисляться лежит в основе его биологического действияв клеточном метаболизме.
Имеются сведения, что рибофлавин-УФ сшиваниеу пациентов с КК, способствует синтезу нормального межклеточногоматрикса, снижению уровня АФК и нарушений ими вызываемых (Spoerl E. etal., 2011; Cheung I. et al., 2014а). Вместе с тем УФ сшивание инициируетапоптоз кератоцитов (Jordan C. et al., 2014). В проведенных намиисследованияхувеличениеодногоизосновныхпараметровлюминолзависимой хемилюминесценции – светосуммы, как в образцах ВПК,так и в супернатантах из гомогенатов роговиц может быть результатомгиперпродукции АФК, опосредующих активацию клеточной гибели в ответна УФ воздействие.Нами исследовано влияние деэпителизации роговицы (без воздействияультрафиолета и рибофлавина) на параметры ХЛ во ВПК. Так, через 1 ч послеудаления эпителия наблюдали рост значений спонтанной светимости исветосуммы ХЛ в 2,5 и в 3 раза, соответственно.
А на 4-е сут, к моментуполного восстановления эпителия, исследованные показатели были на уровнеинтактных животных.Параметрылюминолиндуцированнойхемилюминесценциисупернатантов из гомогенатов роговиц кроликов в целом были аналогичны сданными ВПК, но менее выраженные. Следует отметить, что в модельнойсистеме с супернатантами из гомогенатов роговиц животных, в отличие отсистемы с ВПК, появляется гораздо большее количество компонентов клетоки ЭЦМ.204УФоблучениероговицыбезрибофлавинаспособствовалодостоверному усилению основных параметров ЛЗ ХЛ супернатантов изгомогенатов роговиц кроликов.
Менее выраженный рост этих значенийрегистрировали в опытных группах УФ сшивания с растворами рибофлавинаили в группе с деэпителизацией роговицы. Показатели ЛЗ ХЛ супернатантовгомогенатовроговицчерез1чпослерибофлавин-УФ-воздействиядемонстрировали максимальное усиление процессов СРО в отличие отрезультатов, полученных при исследовании образцов ВПК, подтверждаяпредположениеотом,чтоугнетениезначенийхемилюминесценциипроисходило именно за счет трансстромальной диффузии рибофлавина впереднюю камеру глаза.Результаты железоиндуцированной ХЛ супернатантов из гомогенатовроговиц после УФ облучения и УФО с рибофлавином показали достоверныйрост спонтанной светимости и амплитуды медленной вспышки в срокнаблюдений 1 час - 4 сут по отношению к контролю, с постепенным (к 14 сут)снижением значений до нормы.
В то время как величина светосуммы имеламаксимальные значения через 1 час после воздействия.При исследовании супернатантов из гомогенатов глазных яблокнаибольшие значения параметров ХЛ (спонтанная светимость, амплитудамедленной вспышки, светосумма) регистрировали через 1 час после УФО иУФ сшивания с рибофлавином с характерным снижением показателейпрактически до нормы к 14 сут эксперимента.
При этом протекторноедействие рибофлавина в процессе УФ облучения проявлялось не в стольинтенсивном росте параметров ЖИ ХЛ.Повреждающее действие деэпителизации на фоне целого глазногояблока представляется не столь значительным, что, соответственно, не влиялона значения ХЛ. Так, к 4 сут амплитуда медленной вспышки и светосуммасвечения были в пределах значений контроля, а спонтанная светимостьпревышала норму на ~ 25%. Таким образом, активация процессов СРО с205образованием АФК в тканях роговицы при кросслинкинге происходилоглавным образом за счет УФ излучения. АФК участвуют в передаче сигнала,связанного с действием первичных мессенджеров, которые в свою очередьосуществляют регуляцию уровня АФК в клетке с участием цитокинов.Повышениепрочностикорнеальнойтканинапрямуюсвязываютс«коллагенсшивающим» эффектом АФК в процессе рибофлавин-УФ облученияроговицы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
