Диссертация (1174186), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Особенности морфологических изменений роговицы кролика после ееультрафиолетового сшивания с растворами рибофлавина по даннымконфокальной микроскопииДля выявления прижизненных морфологических особенностей роговицыкроликов после УФ сшивания с растворами рибофлавина применяли методконфокальной микроскопии, позволяющий исследовать изменения в слояхоптической оболочки глаза на микроструктурном уровне, оценивать состояниеклеток на различной глубине стромы в динамике. Исследования проводили на18 кроликах (36 глаз), которых разделили на 6 групп (по 3 кролика в каждой): 1– интактные (контроль), 2 – УФО без рибофлавина, 3 – УФО с растворомизоосмотического рибофлавина, 4 – УФО с Декстралинк, 5 – УФО с Риболинк,6 – УФО с Хитолинк. Срок наблюдений – 3, 7, 14, 30 и 90 сут.До 14 сут после УФ воздействия во всех опытных группах наблюдалиявления эпителиопатии с десквамацией клеток и полиморфизм клетокбазального эпителия (с визуализацией различных по размерам и контрастностиклеток).
Определяли апоптоз кератоцитов в виде сетчато-расположенныхклеток на 3-30 сут после УФ сшивания в переднем и менее выражено – всреднем слое роговицы. Такая морфологическая картина характерна длялакунарного отека роговицы (Рисунок 51, 1В). В последующем (30-90 сут)явления отека в слоях стромы спадали, что отмечалось уменьшениемсетчатости.По данным конфокальной микроскопии морфологические измененияпосле УФО (без рибофлавина) носили выраженный патологический характер.Наблюдалиявлениясопровождающийсяэпителиопатии,интенсивнойгибельюзначительныйкератоцитовотекистромы,помутнением(хейзом) роговицы.
В срок до 90 сут отмечали усиленный апоптоз кератоцитов,который визуализировали в виде контрастной сетчатости (Рисунок 51, 1Б).1631А2А3А1Б2Б3Б1В2В3В1Г2Г3ГРисунок 51 - Микроскопическая картина слоев роговицы кролика на 30 сут послеУФ воздействия: А – интактные, Б – УФО (без рибофлавина), В – УФО сРиболинк, Г – УФО с Хитолинк.Конфокальная микроскопия, увеличение×300. Глубина: 1 – до 120-160 мкм, 2 – до280-320 мкм, 3 – эндотелий роговицы (400-420 мкм).164Апоптотированные кератоциты определяли практически на всю глубинустромы (до 400 мкм) в течение всего эксперимента (90 сут), при этом полноговосстановления их количества так и не наблюдали. Отмечали складчатостьстромальных слоев за счет коллагеновых «сшивок» (Рисунок 51, 2Б).
Впоследующем на 30-90 сут явления отека снижались. УФ излучение вызвалоповреждение эндотелиального слоя клеток, которое регистрировалось в видестатистически значимого снижения их плотности (~ на 54%, р<0,05), измененияправильной гексагональной формы и нарушения упорядоченности оставшихсяклеток (Рисунок 51, 3Б). Все говорило о повреждающем действии УФизлучения на ткани роговицы в отсутствие фотосенсибилизатора.Данныеконфокальнойизоосмотическиммикроскопиирибофлавином,послерастворомУФкросслинкингаДекстралинкисРиболинксвидетельствовали о развитии однотипных морфологических изменений в слояхоптической оболочки глаза и отсутствии какой-либо значимой разницы влиянияФС на процессы сшивания роговичного коллагена.
Отличием в применениирибофлавинсодержащихрастворовбылонарушениегексагональностииуменьшение размера клеток эндотелия (Рисунок 51, 3Г), а также снижениеплотности эндотелиоцитов при использовании для УФ сшивания раствораХитолинк (Таблица 25).На 7-30 сут после рибофлавин-УФ-кросслинкинга (группы 3, 4, 5) впередней строме (120-160 мкм) отмечали максимальное снижение плотностикератоцитов в среднем на 54% (р<0,05) от значений интактного контроля, а приУФ сшивании с Хитолинком (группа 6) – на 68,7% (р<0,05) (Таблица 25). Приэтом апоптотированные клетки роговицы наблюдали на глубине до 380 мкм, вслояхстромырегистрировалискладчатость,обусловленнуюэффектом«стягивания» (Рисунок 51, 2В).
С 30 сут наблюдали появление единичныхактивированных кератоцитов (фибробластов) в виде ярких контрастных клеток(Рисунок 51, 2Б-2Г). К этому сроку плотность кератоцитов полностью невосстановилась.165Таблица 25 - Влияние УФ сшивания роговицы кролика с растворами рибофлавинана плотность кератоцитов и эндотелиальных клеток по данным конфокальноймикроскопии (клеток / мм2, M±σ)Группа / срокнаблюденийизоосмотическийУФО безрибофлавинаУФО +рибофлавинУФО +ДекстралинкУФО + Риболинк120-160 мкм 280-320 мкм 380-420 мкмПлотностьклетокэндотелия90 сут346±2991,5±12*83,5±14*142±15*104±32*98±24*297±2878,5±19*70±11*101,5±18*123±21*108±22*269±2383±10*92,5±11*134,5±22*160±27*135,5±29*3120±862197±75*2080±93*1920±71*1564±82*1435±118*3 сут181,5±20*158±19*235±223032±1017 сут170±21*143±13*216±183152±8214 сут164,5±18*128,5±18*239,5±203007±9830 сут196,5±21*162±23*277±253090±8590 сут232±28213,5±25234,5±293064±633 сут175,5±22*136±25*228±263102±777 сут170±19*123,5±17*230,5±203015±6514 сут159,5±25*120±28*206,5±342954±7330 сут201,5±29*147±24*222±183020±11490 сут212±20189,5±31243±253109±963 сут202±17*151±30*244±233032±847 сут183,5±20*135,5±24*221±273125±9814 сут180±22*139±21*235±243105±8030 сут191,5±20*177,5±17*218,5±302994±10690 сут220±21185±24*235,5±323220±913 сут190,5±19*138±28*215±262832±837 сут163±24*119,5±20*228,5±252630±9014 сут135±27*144±21*168±182785±7830 сут141±24*130±18*193±282618±10990 сут108±23*120,5±22*184,5±242635±95Интактные (контроль)3 сутУФО + ХитолинкПлотность кератоцитов в слоях стромы7 сут14 сут30 сут*р<0,05 – достоверность различий показателя при сравнении с интактным контролем.166Прииспользованиираствороврибофлавина(изоосмотического,Декстралинк и Риболинк) в задних слоях стромы (380-420 мкм) и эндотелиироговицы патоморфологических изменений не обнаруживали (Рисунок 51,3В).
При УФ сшивании с Хитолинком на этой же глубине стромы в срок до90 сут наблюдали снижение плотности кератоцитов (на 31%) и клетокэндотелия (на 16%) с утратой их физиологичной формы (Рисунок 51, 3Г),однако результаты не имели статистически значимых отличий в сравнении синтактным контролем.Таким образом, прижизненный морфологической анализ оптическойоболочки глаза кролика по данным конфокальной микроскопии показал, чтоУФ воздействие на роговицу без фотосенсибилизатора вызывает в нейзначимые изменения патологического характера: явления эпителиопатии,усиление апоптоза кератоцитов во всех слоях стромы, развитие лакунарногоотека и роговичного помутнения, снижение плотности клеток эндотелия,нарушение их упорядоченности и формы.
УФ сшивание в присутствиирибофлавинсодержащихрастворовхарактеризуетсяявлениямиэпителиопатии, активацией гибели кератоцитов, появлением микроскладок илакунарного отека преимущественно в передних и средних слоях стромы, присохранении плотности эндотелиальных клеток. Кроме указанных измененийдляраствораХитолинкбылохарактернымснижениеплотностиэндотелиоцитов.4.7.ОценкаофтальмологическихбезопасностирастворовдлябиологическогоУФсшиваниядействияроговицы(приложение)Цитотоксичность in vitro на культуре фибробластов мышиОпределение цитотоксического потенциала растворов (экстрактов израстворов) Декстралинк, Риболинк, Хитолинк проводили in vitro на культуре167фибробластов мыши.
Выполняли качественную оценку цитотоксичности,исследуяморфологиюицелостностьмембранклеток,атакжеколичественную – по числу погибших клеток. Контроль – 0,9% растворнатрия хлорида.В клеточных культурах с экстрактами из растворов Декстралинк,Риболинк и Хитолинк клеточная реакция отсутствовала, цитоморфология безпатологическихизменений,аналогичнаконтролю.Морфометрическиенаблюдения показали уменьшение числа клеток на 3%, 2% и 5%,соответственно, для растворов Декстралинк, Риболинк и Хитолинк, всравнении с контрольным раствором.
Выявленная незначительная разница сконтрольной группой является допустимой и согласуется с установленнымитребованиями.Степень реакции клеток при использовании растворов опытных группне имела значимых отличий от контроля («0» баллов) и по шкале клеточнойтоксичности соответствовала «0» баллов, при допустимых значениях от 0 до1 балла.Качественнаяоценкаклеточныхкультур,растворов,включалацитотоксичностиинкубированныхтакжеспосредствомэкстрактамивизуализациюизмикроскопииисследуемыхцелостностимембраниконстатацию лизиса клеток, при этом производили также количественнуюоценка гибели клеток, вызванной их лизисом. Микроскопия культур клеток сэкстрактами контрольного и всех исследованных растворов (Декстралинк,Риболинк и Хитолинк) демонстрировала полное отсутствие лизиса клеток –0%.Такимобразом,проведенныеисследованияневыявилицитотоксического действия растворов Декстралинк, Риболинк и Хитолинк invitroнакультурефибробластовмыши.Количественнаяоценкацитотоксичности показала гибель 3%, 2% и 5% клеток при инкубации168клеточных культур с экстрактами растворов Декстралинк, Риболинк иХитолинк,соответственно,поотношениюкконтролю;приэтомкачественные показатели цитотоксичности показали отсутствие лизисаклеток.Оценка раздражающего действия in vivo на кожу кроликовДля определения раздражающего действия растворов ДекстралинкРиболинк и Хитолинк на кожу век оценивали кожную реакцию в баллах,рассчитываявключенныхиндексвпервичногоисследования.раздраженияВкачествеу12кроликов-самцов,контроляиспользовалиизоосмотический раствор рибофлавина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
