Диссертация (1173358), страница 15

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 15)

Вы добавитеэтот буфер к собранным клеткам. Лизирующий буфер содержит детергент —поверхностно-активное вещество, разрушающее фосфолипидные мембраны клеток.Чтобы отделить высвобождающуюся ДНК от белковых примесей в ёмкость склетками также потребуется внести разрушающий белки фермент — протеазу. Послеэтого суспензию клеток необходимо выдержать десять минут при оптимальной дляработы фермента температуре — +50°С. Кислотность среды, оптимальную для работыфермента, обеспечит лизирующий буфер.Для того чтобы выделить ДНК из раствора достаточно разбавить его большимколичеством спирта.

В этих условиях растворимость ДНК резко снижается и веществовыпадет в осадок. В водно-спиртовой смеси образуются тонкие белые нити, которыеможно хорошо рассмотреть невооружённым глазом.4.Обсуждение рабочего места и состава штативов (3 минуты)Эксперимент проводится в рабочих группах по два человека. Каждый участникгруппы должен выделить собственную ДНК, выполнив все необходимые для этогопроцедуры.

Для каждой группы подготовлен набор реактивов и расходных материалов,который представлен в таблице 11:Таблица 11 – Обучающий эксперимент: состав штатива для выполнения практикумаучастниками ЭГ2101Тип пробиркиСодержимоепробирка на 15 млОбъёмКол-вожидкости пробирокПитьевая вода 3 мл2 шт.пробирка на 15 мл10 мл1 шт.ПодписываютсяучастникамиЭГ2«Лизис»1 мл1 шт.«Протеаза»–2 шт.ПодписываютсяучастникамиЭГ2Буфер длялизисацветная микропробирка Растворна 2 млпротеазыпрозрачная–микропробирка на 2 млДополнительные компоненты штатива:одноразовые пипетки Пастераёмкость для мусораперчаткиочки защитные лабораторныехалатнесмывающийся фломастер для маркировки пробирок5.Подпись8 шт.1 шт.2 пары2 шт.2 шт.1 шт.Выполнение экспериментально-практической работы по выданному участникампротоколу (30 минут)ПРОТОКОЛШаг 1 «Сбор клеток»Простейший способ увидеть вашу ДНК – выделить её из эпителиальных клеток,покрывающих ротовую полость.

Старые и повреждённые твёрдой пищей клеткипостоянно отслаиваются, а их место занимают новые. В нашем эксперименте мы будемиспользовать эпителиальные клетки потому, что их можно очень легко и быстрособрать.1.Возьмите с вашего стола 15–мл пробирку, содержащую 3 мл воды. Подпишите её,указав инициалы. Чтобы собрать достаточное количество эпителиальных клеток102ротовой полости, нужно осторожно пожевать внутренние поверхности щёк в течение 30секунд.2.Наберите воду из 15–мл пробирки в рот, и тщательно полощите его в течение 30секунд.

Внимание: не глотайте воду!3.Аккуратно перенесите воду обратно в пробирку.Вопросы на понимание процесса сбора клеток:Назовите источник ДНК, которую выделяют в ходе эксперимента:a.Ядра клеток эпителия ротовой полостиb.Митохондрии клеток эпителия ротовой полостиc.Бактерии ротовой полостиd.Все выше названные типы ДНКШаг 2: «Разрушение (лизис) клеток»Для того чтобы проникнуть в клетку и добраться до ДНК, нам придется разрушитьклеточную и ядерную мембраны. Они состоят из особым образом устроенных жиров,которые называют фосфолипидами. В эксперименте мы будем разрушать мембраны спомощью детергента.

Детергенты являются основным компонентом моющих средств.Они растворяют фосфолипидные мембраны точно так же, как это происходит собычным жиром на грязной посуде.1.Используя чистую одноразовую пипетку Пастера, добавьте 2 мл буфера для лизисав пробирку с клетками (буфер содержит детергент и находится в 15-мл пробирке снадписью «Лизис»). Выбросьте пипетку после использования.2.Закрутите пробирку с клетками крышкой, затем аккуратно переверните ёмкость 5раз, но ни в коем случае не трясите ее.Вопросы на понимание процесса разрушения плазматических мембран:Если раствор детергента разрушает клеточную мембрану, то почему мыло неразъедает человеку руки?103Почемужелчь(естественныйдетергент),котораявыделяетсявдвенадцатиперстную кишку, не растворяет клетки эпителия кишечника?Какие молекулы, кроме ДНК, выйдут в раствор после разрушения мембраны клетокдетергентом?Шаг 3: «Удаление белков»Находящаяся внутри клеток ДНК практически всегда плотно связана соспециальными белками – гистонами.

Она аккуратно намотана на них, как нить накатушку. Благодаря этому ДНК занимает в клетке мало места и не запутывается. Чтобыполучить чистую ДНК, необходимо разрушить гистоны и другие ДНК-связывающиебелки. Для этого мы будем использовать протеазу – фермент, способный разрушатьбелковые молекулы.1.Возьмите со стола микропробирку с протеазой (подписана «Протеаза»). С помощьючистой одноразовой пипетки Пастера добавьте к подписанной вами пробирке пятькапель раствора протеазы. Выбросьте пипетку после использования.2.Закройте пробирку с вашим образцом и несколько раз переверните, чтобыперемешать содержимое.3.Установите пробирку в штатив, а затем поместите в водяную баню, нагретую до50°С. Подождите десять минут и перенесите пробирку обратно на стол.Вопросы на понимание процесса разрушения белков:Вещество, разрушающее белки, называется ________________ и являетсябиологическим катализатором, или ___________.Где протеазы находятся в вашем теле? Поясните, почему вы так думаете.Изучите график зависимости относительной активности термостабильной протеазыBacillus sp.

от температуры (по оси х отложена температура (в °С), а по оси у –относительная скорость активность фермента (в %)). Какое из нижеприведённых104описаний наиболее точно характеризует данную зависимость в указанном диапазонетемператур?Рисунок 27 – График зависимости относительной активности термостабильнойпротеазы Bacillus sp. от температурыАктивность фермента протеазы с повышением температуры:a.Резко снижается, достигая своего минимального значения, после чего резкорастётb.Медленно растётc.Растёт, достигая своего максимального значения, после чего резко начинаетснижатьсяd.Плавно колеблется около средних значенийДобавление к клеткам детергента позволяетa.Осадить ДНК из раствора105b.Растворить белки, связанные с молекулой ДНКc.Растворить мембраны клеткиd.Осадить белки, растворённые в цитоплазмеШаг 4: «Осаждение ДНК»На этом этапе эксперимента в пробирке находится раствор, содержащий не толькоДНК, но и многие другие вещества, высвободившиеся из разрушенных детергентомклеток.

Для того, чтобы отделить ДНК от остальных соединений в растворе, достаточнодобавить в пробирку холодный спирт. Это приведет к тому, что растворимость ДНКрезко снизится. Она выпадет в осадок, который можно рассмотреть невооружённымглазом.1.Возьмите у учителя ёмкость с холодным спиртом. Держа пробирку с вашимобразцом под углом, добавьте туда с помощью чистой одноразовой пипеткиПастера 10 мл спирта, так, чтобы он медленно стекал по стенке.

Завинтите крышкуна пробирке. Содержащаяся в растворе ДНК начнёт выпадать в осадок.2.Установите пробирку прямо перед вами в штатив на 5 минут и не прикасайтесь кней в течение этого времени, чтобы не нагревать теплом своих рук.3.Медленно переверните пробирку 5 раз. Обратите внимание на плавающие врастворе белые или прозрачные нити. Это ваша ДНК! Она выпала в осадок. Выможете отобрать пипеткой со дна 1 мл содержащего осадок раствора, перенести егов прозрачную микропробирку и хранить ДНК там, удивляя друзей.Вопрос на понимание процесса осаждения ДНК:Засчёт чего спирт позволяет перевести ДНК в нерастворимую форму?Вопросы на понимание всей экспериментально-практической работы:1.Соотнесите реагент, необходимый для выделения молекулы ДНК и температурныеусловия, при которых его работа оптимальна (таблица 12):106Таблица 12 – Задание 1 для ЭГ2 на понимание экспериментального практикума2.РеагентТемпература1.

Буфер для лизиса2. Протеаза3. Спирта. –20 °Св. Комнатная температурас. + 50 °ССоотнесите экспериментальные процедуры (справа) и их результаты (слева)(таблица 13):Таблица 13 – Задание 2 для ЭГ2 на понимание экспериментального практикума1. Собрать клеткиa. Добавить протеазу и инкубироватьпри 50 ºС2. Растворить клеточные мембраныb. Добавить холодный спирт3. Разрушить белкиc. Добавить раствор детергента4. Осадить ДНКd. Пожевать внутренние поверхностиваших щёк и тщательно прополоскатьводой6.Обсуждение результатов экспериментального практикумаПредложенный формат экспериментального исследования позволил сравнитьэффективность усвоения материала в экспериментально-практической среде обучениябиологиисуровнемусвоенияматериалапритрадиционнойорганизацииобразовательного процесса.

На момент начала проведения эксперимента все участникиЭГ1 и ЭГ2 уже изучили тему «Нуклеиновые кислоты». В соответствии с п. 1.3.программы проведения эксперимента контрольный эксперимент проводился в форматетестирования ЭГ1 и ЭГ2. Обеим группам было предложено ответить на вопросы свыбором варианта ответа и вопросы с открытым типом ответа. Задания с выбором ответа107оценивались в 2 балла за каждый правильный ответ и 0 баллов за неправильный илиотсутствующий ответы, на выполнение давалось 5 минут. Задания с открытым типомответа оценивались в 1 – 3 балла за каждый правильный или частично правильный ответи 0 баллов за неправильный или отсутствующий ответы, на их выполнение давалось 15минут.

Перевод полученных баллов в «пятибалльную шкалу» осуществляетсяследующим образом:•5 баллов – при выполнении 75 – 100 %;•4 балла – при выполнении 50 – 75 %;•3 балла – при выполнении 25 – 50 %;•2 балла – при выполнении менее 25 %.Вопросы с вариантами ответа.1.2.3.В состав нуклеотидов ДНК не входит:a.рибозаb.дезоксирибозаc.фосфатd.азотистое основаниеКакое азотистое основание комплементарно аденину (A) в молекуле ДНК?a.цитозин (C)b.гуанин (G)c.тимин (T)d.урацил (U)В каких органеллах клетки содержится ДНК?a.эндоплазматическая сетьb.ядроc.аппарат Гольджиd.клеточный центр1084.Какой тип химической связи в наибольшей мере поддерживает вторичнуюструктуру молекулы ДНК?5.6.7.8.a.ковалентныйb.ионныйc.водородныйd.гидрофильно-гидрофобное взаимодействиеВ двуцепочечной молекуле ДНК гуанин (G) и цитозин (C) соединены:a.двумя пептидными связямиb.двумя водородными связямиc.тремя водородными связямиd.тремя ионными связямиКакие функции выполняет ДНК в клетке?a.биосинтез нуклеотидовb.формирование веретена деленияc.клеточное дыханиеd.хранение и реализация наследственной информацииВыберете правильный состав нуклеотида ДНК:a.дезоксирибоза, урацил, остаток фосфорной кислотыb.рибоза, аденин, остаток фосфорной кислотыc.дезоксирибоза, аденин, остаток фосфорной кислотыd.рибоза, урацил, остаток фосфорной кислотыВ 1962 году за расшифровку структуры ДНК Нобелевскую премию по физиологиии медицине получили:a.Джеймс Уотсон, Фрэнсис Крик и Морис Уилкинсb.Реймонд Гослинг, Лайнус Полинг и Розалинд Франклинc.Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крикd.Джеймс Уотсон, Фрэнсис Крик и Розалинд Франклин109Процесс повреждения ДНК называется:9.a.

Характеристики

Список файлов диссертации