Диссертация (1173269), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Комплексноемикробиологическое исследование, включающее микроскопию мазков, которыеокрашивалисьпоГрамму,культуральноеисследование,молекулярно-биологическое исследование ДНК половых инфекций методом ПЦР-диагностики,позволило оценить спектр возбудителей.Для проведения микроскопии материала, полученного из влагалища,цервикального канала и полости матки, его окрашивали по Грамму и проводилиисследование под микроскопом при увеличении с иммерсией; культуральноеисследование проводилось в аэробных условиях с пониженным содержаниемкислорода в атмосфере СО2.Состояние микробиоценоза при микроскопииоценивалось по совокупности следующих признаков: оценка лейкоцитарнойреакции, характер эпителия, качественный и количественный состав микрофлоры.Дляполученияотделяемогомaтeриaлaцервикальнымдляканаломбaктeриoлoгичeскoгoисодержимогоисслeдoвaнияполостиматкииспользовались одноразовые стерильные инструменты: скринет, эндобраш(производство HARMA-MED Inc.).
Отделяемое из цервикального канала ибиоптат эндометрия из полости матки наносили на набор стандартных5454питательных сред и проводили культивирование в аэробных, анаэробныхусловиях и в условиях пониженного содержания кислорода.Для выделения кокковой флоры посев был проведен на молочнокислый агар(обнаружениештаммовстафилококка),накровянойагар(обнаружениестрептококка), на среду Энди-Расселя (для обнаружения кишечной флоры).Выделение Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum удалось при помощииспользования тест-системы «Mycoplasma DUO» («BIORAD»). Инкубацию средпроводили в течение 18 часов при температуре 37°С.
В эксикаторе в условияхпониженногосодержаниякислородаватмосфереСО2выращивалимикроаэрофилы (гарднерелла, лактобациллы). Для культивироания строгиханаэробов применяли оборудование, способное обеспечить анаэробные условия:анаэробная камера с атмосферой трехкомпонентной газовой смеси (N2 – 80%,CO2 – 10%, H2 – 10%).Выявленные микроорганизмы были распознаны по видовому составу.
Такжеопределили их количество в единице объема пробы (КОЕ/мл) и выявиличувствительность к антибактериальным препаратам диско-диффузным методом(10 дисков). В последующем проводили учет результатов.Выявить ДНК хламидий, гениальных уреаплазм, микоплазм, вируса простогогерпеса I и II типов, цитомегаловиуса, вируса папилломы человека удалось спомощью ПЦР-теста. ПЦР-диагностику проводили в лаборатории молекулярнойдиагностики.Для ПЦР-теста в качестве материала использовали соскобы эпителияцервикального канала, нативного биоптата эндометрия, которые были взятыотдельными одноразовыми стерильными зондами следуя дизайну исследования.Далее они помещались в одноразовые пробирки с транспортной средой и такимобразом их доставляли для изучения.55552.2.3 Морфологическое исследование эндометрия, децидуальнойткани и ворсин хорионаГистологический анализ материала проводили Московском городскомцентре патологоанатомических исследований на базе Городской клиническойбольницы им.
В.П. Демихова г. Москвы.В качестве материалов для исследования использовались ткани плодногояйца и элементы эндометрия, выделенные из полости матки в результатепроведенногомедикаментозногоабортапоповодунеразвивающейсябеременности у пациенток основной группы, а также абортный материал,полученный при вакуум-аспирации содержимого полости матки у пациентокконтрольной группы. Затем производили двадцатичетырехчасовую фиксациюфрагментов в растворе нейтрального формалина (10%).
Позже производилизаливку тканевых фрагментов в парафиновые блоки (точка плавления54-56°С), подготавливали микротомные срезы толщиной 5-7 микрон, которыепосле стандартных гистологических проводок окрашивались гематоксилин эозином, а также пирофуксином по Ван Гизону.
После морфометрическогоанализапрепаратовотбиралиблокиспариетальнымибазальнымэндометрием, т.е. с маточно-плацентрной областью (по наличию якорныхворсин, слоя фибриноида, инвазирующего цитотрофобласта и маточноплацентарных артерий).2.2.4 Методы диагностики системной эндотоксинемии и активностиантиэндотоксинового иммунитетаВерификация бактериального ЛПС в плазме крови возможна с помощьюмикро-ЛАЛ-теста (Limulus Amebocyte Lysate - тест), который основан наспособности гемолимфы рачка Limulus polyphemus коагулироваться при контактес эндотоксином любого происхождения. Единицей измерения является EU/ml(единицы эндотоксина/мл, международная единица активности) [7, 43].5656Микро-ЛАЛ-тест оценивает реакцию при концентрации эндотоксина 0,1 EUЛПС в 1 мл центрифугированной на 1000 оборотахв течение 10 минуткапиллярнорной крови.
Лабораторную посуду помещали в алюминиевую фольгуи прогревали в течение трех часов при температуре 300 °C. Перед постановкойтеста контрольные и опытные образцы разводили апирогенной водой (1:10),прогревали 10 минут на водяной бане при температуре 80°C, охлаждали,добавляли такой же объем лизата амебоцитов, разведенного водой, и полученнуюсмесь инкубировали 45 минут в термостате при температуре 37°С. Визуально, атакже с помощью микроскопии на основе метода кристаллографии, который былразработанвинституте,оцениваливыраженностьреакции.Степеньполимеризации и кристаллизации субстрата в опытных и контрольных образцахсравнивали с известным содержанием стандартного эндотоксина (пирогенала),растворенного в апирогенной донорской плазме. Состояние геля и дисперсностькристаллической сетки, образованной белковым лизатом в инертном разводящемрастворе,позволяливыделятьэкземплярыссодержаниемэндотоксина.Результаты реакции после специальной обработки документировали и оценивалипод микроскопом по специальной калибровочной шкале [13, 81].Методомопределенияактивностигуморальногоантиэндотоксиновогоиммунитета является «СОИС-ИФА» (скрининг-оценка иммунного статусачеловека).Скрининговаядиагностическаятехнологияоснована наопределенииантиэндотоксиновых антител к наиболее общим антигенным детерминантамлипополисахарида, а именно: к Re-гликолипиду, который содержит в своейструктуре исключительно липид-А и три молекулы кетодезоксиоктаната, ивходит в состав липополисахаридов всех грамотрицательных бактерий; и ЛПСE.coli 014, содержащему антиген Кузина (общий антиген энтеробактерий).Измеряется в условных единицах оптической плотности [81].Техника проведения СОИС-ИФА.
Венозную кровь центрифугировали при1500 об/мин в течение 5 мин. Затем надосадочную жидкость замораживали притемпературе -20°C и не позднее чем через 2 месяца исследовали виммуноферментом анализе на специально подготовленных полистироловых5757планшетах, сенсибилизированныхгликолипидом Re и ЛПС E.coli 014.Исследуемые образцы сыворотки или плазмы вносили в лунки, инкубировали при37°C 1 час, затем промывали, опять инкубировали с конъюгатом протеина А спероксидазой, снова промывали, затем 20 мин инкубировали с проявляющимраствором.Затемостанавливалиреакциюсернойкислотой,определялипоказатели экстинции при длине волны 495 нм на спектрофотометре «STATFAX» в условных единицах оптической плотности (у.е.о.п.).2.2.5 Определение уровня провоспалительных цитокинов иконцентрации трех основных классов иммуноглобулинов в сывороткекровиСодержаниеИЛ-1β,периферическойкровиИЛ-6иФНО-αопределялосьиммуноферментного анализавобразцахметодомсывороткитвердофазногос использованием тест-систем АО «Вектор-Бест» (Россия): Интерлейкин-1 бета-ИФА-БЕСТ, Интерлейкин-6-ИФА-Бест иальфа-ФНО-ИФА-БЕСТ.
Федеральная лицензия № 99-04-000086. Наборреагентов для ФНО-α соответствует номеру А-8756, для ИЛ-1β А-8766, дляИЛ-6А-8768.Учетрезультатовпроизводилинапланшетномспектрофотометре Infiniti F50 («TECAN», США).Определение ФНО-α в сыворотке крови, ИЛ-1b, ИЛ-6 в сыворотке кровипроводили с помощью спектрофотометра вертикального сканирования,позволяющего проводить измерения оптической плотности раствора в лункахпланшета при длине волны 450 нм; 620-650 нм.На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцыинкубировали в лунках с иммобилизованными антителами. Имеющийся вобразцах ФНО-α или ИЛ-1b или ИЛ-6 связывается с иммобилизованнымиантителами.Интенсивностьжелтогоокрашиванияпропорциональнаколичеству содержащегося в образце ФНО-α или ИЛ-1b или ИЛ-6.Определение концентрации IgM, IgA и IgG в сыворотке периферическойкрови проводили турбидиметрическим методом на биохимическом анализатореАБхФк (Россия) с применением коммерческих наборов в соответствии с5858инструкцией производителя (Human, Германия).
Исследуемый образец вносили вкювету, которая содержала буфер и антииммуноглобулиновую сыворотку,инкубировали 10 минут при температуре 37°С. Измерение проводили противхолостой пробы, которая содержала буфер и исследуемый образец и не содержалаантисыворотку.Количественнуюоценкусодержанияиммуноглобулиновопределяли по калибровочной кривой.2.3 Статистическая обработка материалаДлястатистическойобработкиданныхиспользовалисьметодыпараметрической и непараметрической статистики.Методом описательной статистики оценивалось сpеднее аpифметическое(M), ошибка сpеднего значения (m) − для признаков, которые имели непрерывноераспределение; а также частоты встречаемости признаков с дискретнымизначениями.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
