Диссертация (1173214), страница 30
Текст из файла (страница 30)
Одним изклассических методов диагностики дисфункции эндотелия является определениеколичествациркулирующихпериферическойкровидесквамированных[154].эндотелиальныхЭндотелиоцитыявляютсяклетоквлабильнымибиоструктурами, что позволяет использовать регистрацию их морфологическихизменений в качестве информативного критерия нарушений в микрососудистомрусле. Компьютеные технологии сегодня позволяют фиксировать минимальныеотклонения в структуре биологического объекта, маркируя доклинические стадииболезни. Десквамированные эндотелиоциты – это цикулирующие в кровотокеэндотелиальные клетки, отделившиеся от стенки сосуда и являющиесядостоверным параметром цитологической диагностики дисфункции эндотелия[123; 170].
Количество циркулирующих эндотелиоцитов в периферической кровив норме очень мало, т.к. процесс самообновления интимы сосудов проходитмедленно,адесквамированныеретикулоэндотелиальной системойклеткиинтенсивноразрушаются[147]. Продолжительность нахождениядесквамированных эндотелиоцитов в крови составляет около 24-42 часов, втечение которых происходит их захват и разрушение макрофагами печени, лёгкихи селезёнки [48].
Тем не менее, отмечется повышение концентрации этих клеток в197периферичекской кровотоке при заболеваниях, сопровождающихся сосудистыминарушениями (сахарный диабет, сердечно-сосудистые заболевания, нарушениемозгового кровообращения, васкулиты и т.п.) [166; 170]. Метод подсчетаколичества циркулирующих ДЭК, разработанный J.Hladovecс соавт. (1978),основан на визуальной количественной оценке десквамированных клеток путемсветовоймикроскопииэндотелиальная[154].дисфункцияПометодуJ.Hladovecдиагностируетсяприcсоавт.значении(1978),показателя,превышающем 2,77×105 в 1 л плазмы. По данным В.С. Савельева (2010)количество циркулирующих эндотелиоцитов в плазме крови в норме составляетот 2 до 4 единиц/100 мкл [100]. П.Е.
Асташев (2011) предложил выделять степениэндотелиальной дисфункции по количеству десквамированных эндотелиальныхклеток [9]: при значениях количества ДЭК от 6 до 10 клеток степень повреждениястенок сосудов расценивали как легкую, от 11 до 25 – среднюю, а от 26 и выше –как выраженную.Нами проведена оценка состояния эндотелия у беременных с помощьюморфоденситометрического исследования десквамированных эндотелиоцитовпериферическойкрови.Помимообщепринятойметодикиподсчетациркулирующих ДЭК периферической крови, была разработана технологиявитальнойкомпьютернойморфоденситометриидесквамированныхэндотелиоцитов, позволяющая оптимизировать диагностику эндотелиальнойдисфункции с позиций доступности и малоинвазивности метода, основанного наанлизе изучаемой патологии на клеточном уровне.Внаучнойлитературеиспользованиеморфометричесогометодависследовании циркулирующих ДЭК имеет отражение лишь в единичных работах.Какизвестно,апоптозявляетсяосновныммеханизмомповрежденияэндотелиоцитов [27; 33; 41; 87].
Наиболее простым и доступным методомидентификации и исследования морфологииапоптических клеток считаетсясветовая микросокпия [71]. В.И. Козловский и соавт. (2008) исследовалиморфологию циркулирующих ДЭК с помощью световой микроскопии [48]. Вработе показано увеличение количества клеток с признаками апоптоза у больных198с артериальной гипертензией.
В литературе упоминается методика проточнойцитометрии десквамированныхэндотелиоцитов, которая используется дляопределения количества «зрелых» ДЭК и исключения клеток, с измененнойгеометрией [175]. Метод проточной цитометрии основан на фиксации сигналовсветорассеяния и флюоресценции луча лазера от исследуемого биологическогообъекта. В работе деформированные и поврежденные клетки исключали изанализа, таккак они дают слабое рассеивание.
Увеличение же в кровисодержания «зрелых» ДЭК связывали с патологией в ответ на повреждениестенки сосуда [123; 175]. В зарубежной литературе мы нашли ссылку на методсортировки циркулирующих ДЭК, активированных флюоресценцией, и расчетасоотношения между апоптозными клетками эндотелия (СD-146) и клеткамипредшественниками (CD-34), как показатель степени поражения эндотелиоцитов[202].Научных работ с детальным исследованием морфометрических параметровциркулирующих ДЭК периферической крови в доступной литературе наминайдено не было.
Тем не менее, морфоденситометрическое исследованиециркулирующихисследованияДЭКсостоянияпредставляетсяэндотелия.перспективнымИзучениепатогенезанаправлениемэндотелиальнойдисфункции позволяет рассматривать минимальные отклонения в структуреклеток как важные маркеры необратимых изменений в эндотелиальном аппарате,своевременная регистрация которых является важным шагом в профилактике илечении сосудистой патологии.В нашем исследовании при сравнении показателей среднего количестваДЭК в исследуемых группах получено статистически достоверное повышениеболее чем в 2 раза в группе беременных с несостоявшимся выкидышем: 12,6±5,89×104клеток/100мл в основной группе и 5,5±2,12×104 клеток/100мл в контрольнойгруппе (p<0,0001).
При витальной компьютерной морфоденситометрии ДЭКтакже получены достоверные отличия в исследуемых группах. Среднийэквивалентный диаметр ДЭК в группе с физиологическим течением беременностисоставил 43,9±3,99 мкм, что в 1,5 раза выше данного показателя группы с199несостоявшимсявыкидыше29,5±9,40мкм(p<0,0001).ДЭКобладаютполигональной формой, и определение площади и периметра клетки даетдополнительную морфометрическую характеристику оптического объекта. Приапоптозе геометрическая форма клетки изменяется, проходя стадии конденсации,фрагментации (блеббинга) и формирования апоптозных телец. Таким образом,морфометрия клеток позволяет дать дополнительную характеристику степениповреждения эндотелиоцитов, а именно – определить активность апоптоза визучаемой ткани.
Средний периметр ДЭК в контрольной группе составил139,6±14,10 мкм, в основной группе – 93,8±29,90 мкм (p<0,0001). Средняяплощадь ДЭК в контрольной группе – 1546,8±294,11 мкм² и 842,0±484,44 мкм² – восновной группе (p<0,0001). Фактор формы ДЭК – характеристика изрезанностиграницы оптического объекта – составил 12,7±0,11 в контрольной группе,11,2±0,77 – в основной (p<0,0001). Поляризация ДЭК – степень эллиптичностиобъекта: 0,08±0,021 в контрольной группе, 0,14±0,053 в основной группе(p<0,0001).Таким образом, был определен диапазон колебаний морфоцитометрическихпараметров ДЭК у беременных в I триместре беременности при физиологическомтечении беременности и при нарушении гестации.
Полученные результатыпродемонстрировали достоверность отличий выбранных нами параметров ДЭК,чтодефинируетактуальностьморфометрическогоисследованиядесквамированных эндотелиоцитов периферической крови с целью определениянарушенийэндотелияубеременных.Следуетотметить,чтоприморфоденситометрии окрашенных препаратов ДЭК нами были зафиксированыизменения ядер клеток: фрагментация, маргинация и компактизация хроматина сформированием хроматометров, что потверждает участие апоптоза в патогенезеизучаемой патологии и открывает перспективы исследования эндотелиальнойдисфункции на молекулярном уровне.Для оценки состояния эндотелия у плодапроводилась морфометриясосудов хориона, полученного при инструментальном удалении плодного яйца.Материалом исследования служил ворсинчатый хорион соскобов 7-10-ти недель200беременности.
В ходе работы определялись следующие морфометрическиепараметры: диаметр просвета сосуда, средняя толщина стенки сосуда, средняяплощадь просвета сосуда, индекс Керногана – отношение толщины стенки сосудак диаметру просвета сосуда, индекс апоптоза эндотелиоцитов – соотношениеклеток, с морфологическими признаками апоптоза, к общему количествуисследуемыхклеток.морфологическойКритерийособенностьювыборасрокасосудовбеременноститретичныхворсин,определенкоторыеформируются к 7 неделе беременности и до гестационного срока 10 недель всоставе своей стенки не содержат перицитов, что обеспечивает исследованиесостояния эндотелия хориона плода, отождествляя толщину стенки фетальногокапилляра с толщиной эндотелиоцита.
По данным литературы, в 7 недельбеременности стенка фетального капилляра представлена непрерывным слоемпараллельных, многоугольных клеток диаметром 30-50 мкм, которые формируютмонослой. Эндотелиоциты имеют крупные, с многочисленными выпячиваниями,неправильной формы ядра, базальная мембрана и перициты не определяются,площадь просвета капилляров составляет от 20 до 29 мкм2. Большинство клетокэндотелия имеет одно ядро. В мнослое встречаются клетки, у которых ядра нет[95]. Безъядерные клетки представляют апоптотические клетки, закончившиесвой жизненный цикл. Толщина стенок первичных фетальных капилляровсоставляет от 0,15 до 1,2 мкм и опеределяется только толщиной цитоплазмыэндотелиоцитов.
Позже площадь капилляров становится больше, может достигать32-36 мкм2. Эндотелиальная оболочка непрерывна. Объем цитоплазмы вперикарионе эндотелиоцитов уменьшается. В 10 недель стенка капилляраутолщается, появляются клетки перицитов, что завершает формированиефетальных капилляров в хориальной ткани [89].Нарушение гестационного процесса в I триместре отражается на состояниисосудистого русла фетоплацентарного комплекса.
При самопроизвольных абортахна сроке 7-10 недель беременности отмечается множество аваскулярных ворсин,лишьв трети ворсин содержится по 1-2 капилляра [95]. По данным О.В.Трохимович (2015) патоморфологическая картина спонтанного выкидыша201характеризуетсядоминированиемявленийнарушенияпроцессовкровообращения, наличием значительных очагов кровоизлияний, возникающихна фоне резко выраженной дезорганизации процессов апоптоза [119]. О снижениикровоснабжения ворсин свидетельствует общая площадь сосудов в пересчете наодну ворсину, которая составляет лишь 60 мкм2 и не достигает физиологическихпоказателей, соответствующих этому сроку беременности, что говорит оснижении количества, а также диаметра и площади фетальных капилляров [95].В ходе морфометрического исследования нами получены достоверныеотличия в исследуемых группах. Толщина стенки сосуда, состоящей только измнослоя эндотелиоцитов составила 0,7±0,11 мкм в основной группе и 0,9±0,12мкм – в контрольной группе (р<0,0001).
При этом показатели диаметра просветаи площади просвета исследуемых сосудов были практически одинаковы висследуемых группах, что говорит об унификации подбора калибра сосудовворсинчатого хориона с целью стандартизации определяемых морфометрическихпоказателей. Средний диаметр просвета сосуда составил в основной группе6,7±0,38 мкм, в контрольной группе 6,9±0,93 (р<0,05). Средняя площадь сосудатретичных ворсин хориона оставила 36,1±4,62 мкм2 в основной группе, и39,8±10,96 мкм2 в контрольной группе (р<0,05).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
