Диссертация (1150381), страница 2
Текст из файла (страница 2)
833.5.3 Оптимизация условий металл-аффинной хроматографии триптическогогидролизата казеина......................................................................................................... 853.5.4 Фосфопротеомный анализ клеточного лизата HeLa ........................................... 913.5.5 Выделение пептидов альбумина, модифицированных остатком зарина ...........
924Основные результаты ...................................................................................................95Список сокращений ............................................................................................................96Список литературы .............................................................................................................97Приложение....................................................................................................................... 1096ВведениеАктуальность темыМетод получения пленок Ленгмюра-Блоджетт (ПЛБ) позволяет варьировать ихсвойства, меняя структуру полярной части амфифильной молекулы, состав монослоя,раствора (субфазы) и условия переноса на твердую подложку.
Уникальность структур,получаемых по методу Ленгмюра-Блоджетт, обусловила их использование как вфундаментальных, так и в прикладных исследованиях. Комплексная оценка физикохимических и поверхностных свойств ПЛБ позволяет прогнозировать возможность ихцеленаправленного применения.
В последние годы большое внимание уделеноисследованиям ПЛБ на основе стеаратов трехвалентных металлов.Стоит отметить, что трехвалентные металлы являются активными центрамимногих металл-аффинных сорбентов. Металл-аффинная хроматография – это методразделения,основанныйнаразличномсродствегетероатомоворганическихсоединений к ионам металлов, согласно теории жестких и мягких кислот и основанийПирсона. В настоящее время известны два типа сорбентов для металл-аффиннойхроматографии: а) металл-хелатные на основе ионов металлов (Fe(III), Ga(III), Ni(II),Cu(II)),хелатированных полидентантнымилигандами,иммобилизованныминавспомогательной подложке [1]; б) металл-оксидные на основе оксидов металлов, чащевсего в виде свободных нанопорошков, либо связанные на инертном носителе [2].Пленки Ленгмюра-Блоджетт или системы, полученные путем диспергированияколлапсированных монослоев стеариновой кислоты, снятых с поверхности воднойсубфазы,содержащейионыFe(III),имеютповерхность,котораясостоитпреимущественно из ионов железа, надежно связанных с поверхностью твердого тела.Проведенное ранее [3] масс-спектрометрическое исследование состава ПЛБ на основестеарата железа(III) показало, что основным структурным звеном монослоя являетсядистеарат железа(III).
Это позволило сделать предположение о том, что такиеструктурымогутслужитьметалл-аффиннымисорбентами,посколькутретийзаместитель при атоме железа может варьироваться, и связь металла с ним слабее, чемс остатками стеариновой кислоты, и за счет координационных взаимодействий ионажелеза с различными гетероатомами анализируемых соединений возможна их сорбция.7Поиск структур стабильных при проведении процесса хроматографии являетсяважной задачей, и одним из путей ее решения может быть синтез различныхматериалов с малым размером частиц и, как следствие, высокой величиной удельнойповерхности.
К таким структурам можно отнести оксиды переходных металлов.Недавнобылпредложенмодифицированныйзоль-гельметод с совместнымсамораспространяющимся синтезом, индуцированным микроволновым излучением дляполучения оксида циркония в нанодисперсном состоянии [4]. Соответственно, можносделать предположение, что оксид железа(III) также может быть синтезирован этимметодом, а полученную структуру можно использовать как металл-аффинный сорбент.Металл-аффинную хроматографию на сорбентах, содержащих железо(III),применяют в фосфопротеомике – области протеомики, занимающейся белками ипептидами, содержащими фосфорные группы – в качестве метода высокоселективногои специфичного выделения фосфорилированных соединений [5].
По принципуПирсона фосфорная группа, богатая атомами кислорода, имеет сродство к атомамжелеза(III). За счет координационных взаимодействий она обратимо связывается сатомом металла, что позволяет в дальнейшем получать образец, обогащенныйфосфорилированными соединениями.Известны коммерчески доступные сорбенты для задач фосфопротеомики,содержащие железо(III), однако для них характерен достаточно высокий уровеньнеспецифичной сорбции и, как следствие, низкая селективность; невозможностьполучения в лабораторных условиях, а также невозможность использования ваппаратурном оформлении при потоковых анализах.
Кроме того, практическиотсутствует информация о возможности использования металл-аффинных сорбентовдля экстракции фосфонилированных белков и пептидов, содержащих аминокислоты сприсоединенными остатками эфира метилфосфоновой кислоты. Именно к такимсоединениям можно отнести аддукты белков, в том числе сывороточного альбумина, сфосфорорганическими отравляющими веществами: зарином, зоманом, RVx и другими[6].
Специфичное выделение таких аддуктов белков необходимо при ретроспективномхимико-токсикологическоманализедляидентификации отравляющего вещества.установленияфактаинтоксикациии8Научная новизна работыРазработаны и охарактеризованы два новых металл-аффинных сорбента,содержащих трехвалентное железо: коллапсированные монослои стеарата железа(III) инанодисперсные частицы оксида железа(III), полученные золь-гель методом ссовместным самораспространяющимся синтезом, индуцированным микроволновымизлучением. Исследованы структурные и поверхностные свойства новых сорбентов.Показана возможность использования разработанных сорбентов в фосфопротеомноманализе:проведенаисследованаоптимизацияспецифичностьиусловийметалл-аффиннойселективностьсорбентовнахроматографии,примерефос-форилированных триптических пептидов казеина быка и синтетических пептидов,фосфорилированных по различным аминокислотам. Показана возможность селективного выделения аддуктов зарина с сывороточным альбумином человека методом металл-аффинной хроматографии на сорбентах, содержащих трехвалентное железо.Практическая значимость работыСозданные металл-аффинные сорбенты могут быть использованы для решениязадач фосфопротеомики, что востребовано в таких областях, как медицина,аналитическая химия, биохимия и токсикология.Основные положения, выносимые на защиту1.
Регулярная мультимолекулярная структура на основе стеарата железа(III),полученная по методу Ленгмюра-Блоджетт с последующим коллапсированием безпереноса на твердую подложку может быть использована в качестве металл-аффинногосорбента (металл-хелатный сорбент – МХС).2. Золь-гельметодссовместнымсамораспространяющимсясинтезом,индуцированным микроволновым излучением, позволяет получать высокопористыенанодисперсные структуры на основе оксида железа(III) с размером частиц 50-100 нм,которые могут быть использованы в качестве металл-аффинного сорбента (металлоксидный сорбент – МОС).3.
Методика последовательного элюирования 0.4 М водным раствором аммиака,0.5% водным раствором пиперидина, затем 15% раствором ПФОС в 0.5% водном9растворе пиперидина повышает степень извлечения фосфорилированных пептидов посравнению с элюированием любым из перечисленных растворителей.4. Результаты исследования процесса сорбции фосфорилированных пептидов ибелка на полученных сорбентах.5. Результатыэкспериментальногоисследованияселективностииспецифичности сорбции фосфорсодержащих пептидов из простых и сложныхпептидных смесей при использовании предлагаемых сорбентов.Апробация работыОсновные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждалисьна: Всероссийской Молодёжной Конференции "Химия поверхности и нанотехнология"(Казань, 2012); II всероссийской научной конференции молодых ученых “ПроблемыбиомедицинскойВсероссийскойнаукитретьегоконференциитысячелетия”молодыхученых,(Санкт-Петербург,аспирантови2012);студентовVIIсмеждународным участием по химии и наноматериалам «Менделеев 2013» (СанктПетербург, 2013); IV Междисциплинарной конференции «Биологические активныевещества и материалы: фундаментальные и прикладные вопросы получения иприменения» (Новый Свет, Украина, 2013); V-ой Международной конференции-школе«Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения»(Санкт-Петербург, 2013); VI съезде ВМСО, V Всероссийской конференции смеждународным участием "Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы" (Москва,2013).ПубликацииПо материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 4 – вреферируемых журналах, 6 тезисов по материалам научно-практических конференций.БлагодарностиАвторвыражаетглубокуюпризнательностьвсем,ктоспособствовалвыполнению данной работы, принимал участие в обсуждении результатов иоформлении статей.
Автор благодарит своих научных руководителей – к.х.н. Е.П.Подольскую и к.х.н. Н.Г. Суходолова за общее руководство и курирование работы на10всех ее этапах, проверку и обсуждение результатов. Автор выражает благодарностьк.х.н. А.А. Селютину, Е.А. Мурашко, Е.В. Шрейнер, П.Д. Колоницкому, В.Э. Шустову,И.А. Мозгушину за помощь на отдельных этапах работы, а также группе проф. Р.Хоффманна (Университет Лейпцига, Германия) за возможность выполнения частиработы в их лаборатории.111Обзор литературы1.1 Металл-аффинная хроматография1.1.1Общие сведения и принцип действия метода металл-аффиннойхроматографииВ последние годы в аналитической химии большое внимание уделяютвысокоспецифичным и высокоселективным методам пробоподготовки для выделенияорганических соединений из биологических сред и объектов окружающей среды.
Впервую очередь, к таким методам можно отнести металл-аффинную хроматографию(МАХ, англ. IMAC, immobilized-metal affinity chromatography). В научной литературена русском языке также используют названия металлхелатная или лигандообменнаяхроматография.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
