Диссертация (1150381), страница 3
Текст из файла (страница 3)
В основе этого хроматографического метода лежит различное сродствоорганических соединений к ионам некоторых металлов. Ионы металлов в большинствеслучаевхелатируютполидентантнымилигандами,иммобилизованныминавспомогательной подложке. Более подробно различные типы сорбентов для МАХбудут рассмотрены в разделе 1.1.2.Принцип металл-аффинной хроматографии был впервые сформулированПоратом [7]. Он был основана на известном сродстве ионов переходных металлов,таких как Zn2+, Cu2+, Ni2+ и Co2+ к гистидину и цистеину в водных растворах.Впоследствиипоявиласьидеяиспользоватьсорбентынаосновепрочнозафиксированных ионов металлов для фракционирования белков.
Реакция образованиякомплекса иона металла и некоторых функциональных групп (например, фосфатныхгрупп)биоорганическихмолекул,какправило,обратима.Следовательно,иммобилизованные ионы металлов можно использовать как сорбент. Взаимодействиемежду сорбентом и аналитом находится в зависимости от pH, поэтому связанныевещества можно элюировать, изменяя рН, уменьшая ионную силу буфера илииспользуя другие хелатирующие агенты, такие как ЭДТА или имидазол.Одним из наиболее известных приложений МАХ является очистка гистидинмеченных белков (His-tagged белков) [8]. В последнее время наблюдается увеличениепримененияМАХприпроведениипредварительнойобработкиобразцадляобнаружения наркотиков, таких как тетрациклины, фторхинолоны, макролиды, β-12лактамы, аминогликозиды [9, 10]; при пробоподготовки для выявления биомаркеров всыворотке крови, мочи и тканях для диагностики заболеваний с последующимприменением методов масс-спектрометрии [11, 12].1.1.2Сорбенты для металл-аффинной хроматографииВ настоящее время известны два принципиальных типа сорбентов для металлаффинной хроматографии:– Хелатные на основе ионов металлов, хелатированных полидентантнымилигандами, иммобилизованными на вспомогательной подложке (силикагель, агароза,сефароза, сшитый сополимер полистирола и дивинилбензола) [13].– Твердотельные на основе оксидов металлов, чаще всего в виде свободныхнанопорошков, либо связанных на инертном носителе [14].Наиболее часто используемыми при приготовлении хелатных металл-аффинныхсорбентов являются ионы переходных металлов.
Электрон-доноры (N, S и O) вхелатирующих соединениях могут координировать ионы металлов с получениемметалл-хелатов, в диапазоне от бидентатных до пентадентатных соединений, взависимости от числа занятых координационных связей.Ионы металлов чаще всего классифицируют согласно теории ЖМКО (жестких имягких кислот и оснований) Пирсона [15]. Жесткие кислоты (например, ионы Fe3+,Ca2+, Al3+) легче всего координируют кислород и фтор функциональных групп; мягкиекислоты (ионы Cu+, Hg+, Ag+) – серу; промежуточные по жесткости (Cu2+, Ni2+, Zn2+,Co2+) – азот, кислород и серу. Селективность жестких и промежуточных ионовразлична: при оптимальном для их связывания рН (кислом и нейтральномсоответственно), они координируются с разными функциональными группами. Такиегруппы могут содержаться в белках и нуклеиновых кислотах.
"Мишенями" жесткихкислот могут являться аспарагиновая и глутаминовая кислоты, тирозин илифосфорилированные серин, треонин или тирозин. Таким образом, выбор металла дляметалл-аффинного сорбента зависит от структуры анализируемых соединений.Были разработаны различные подложки для МАХ. Традиционно в качественосителя используют мягкий гель, такой как агароза.
Полисахариды, напримерцеллюлоза, обладают преимуществом из-за хорошей биологической совместимости. Ноони демонстрируют низкую механическую прочность и, следовательно, не могут быть13использованы в системах высокого давления. Напротив, неорганическая матрица, такаякак диоксид кремния, обладает превосходными механическими свойствами, но имеетнедостаток в виде необратимой неспецифической сорбции белков [16].Исследования с использованием хелатных сорбентов в основном направлены наобогащение биологических проб фосфорсодержащими пептидами [17, 18, 19, 20, 21], атакже очистке различных производных ДНК, олигонуклеотидов, белков, меченныхостатками гистидина [22, 23].
Ni-содержащий сорбент имеет чрезвычайно высокоесродство к гистидину, на этом основан метод препаративной очистки рекомбинантныхбелков, меченных гистидином. Хелатные сорбенты, как и оксидные, позволяют ввысокой степени селективно выделять фосфорсодержащие пептиды и белки. Однако,имеет место и неспецифичная сорбция примесей, подавить которую полностью неудается, а также возможность вымывания металла из сорбента во время элюирования.Кроме того, для работы с такими сорбентами необходимо дополнительноеоборудование (спиновые колонки, качающаяся платформа). Немаловажным факторомявляется и высокая стоимость таких сорбентов.К настоящему времени известно об использовании в качестве твердотельныхметалл-аффинных сорбентов оксидов многих металлов.
Самым распространеннымявляется оксид титана TiO2, которому посвящено большое число работ по оптимизацииусловий проведения анализа [24, 25, 26, 27], также много внимания уделено оксидуциркония ZrO2 [28, 29]. Были предприняты успешные попытки использовать в качествесорбента для обогащения фосфорилированных пептидов гидроксид алюминия Al(OH)3[30], оксид галлия Ga2O3 [31], оксид ниобия Nb2O5 [32], оксид олова SnO2, которыйпоказал более низкий уровень неспецифического связывания по сравнению с TiO 2 [33],оксид тантала Ta2O5 [34]. Также перспективным следует признать использованиеоксида железа как в варианте магнитных шариков Fe3O4 [35], так и микроразмерногоFe2O3 [36]. Метод так называемой металлоксидной аффинной хроматографии (МОАХ)имеет большое значение в фосфопротеомных исследованиях для выделенияфосфорсодержащих пептидов без дополнительных процедур пробоподготовки, такихкак этерификация и ионообменная хроматография [37].Большое количество работ с использованием таких сорбентов посвященообогащениюобразцовфосфорсодержащимипептидамидлярешениязадачфосфопротеомики [38, 39, 40, 41].
Преимуществом таких сорбентов является простота14использования (особенно в случае нанопорошков, отделяемых от анализируемогораствора фильтрацией или центрифугированием). Большая удельная поверхностьобусловливает высокую сорбционную емкость по отношению к целевым компонентам,однако, одновременно с этим увеличивается неспецифическая сорбция.Использование металл-аффинной хроматографии в протеомных и1.1.3фосфопротеомных исследованияхНа сегодняшний день наиболее активно и плодотворно возможности металлаффинной хроматографии используют в протеомных исследованиях, в которыхснижение сложности (компонентности) системы является необходимым условием прианализе и идентификации малораспространенных белков [42Ошибка! Источникссылки не найден.]. МАХ прочно заняла свое место среди других методовпредварительного разделения сложных смесей, таких как жидкостная обращеннофазовая, ионообменная, аффинная хроматографии и гель-электрофорез [43, 44].
Взависимости от целей и задач, в процессе пробоподготовки МАХ комбинируют сдвухмерным гель-электрофорезом при анализе белков, или с обращенно-фазовойхроматографией для дополнительного разделения пептидов.В протеомике металл-аффинную хроматографию используют в исследованиях,где фракции клеточного белкового пула обогащают для дальнейшего анализа. Так,например, белки со сродством к металлам могут быть обогащены либо с учетом ихспособности связываться с определенным иммобилизованным ионом металла(например, M2+-NTA), либо путем связывания иона металла с белком (М2+-белок) наметалл-аффинном лиганде (например, NTA) [45, 46].
В качестве ионов, пригодных дляметалл-аффинного анализа металлопротеома чаще всего используют Cu2+, Ni2+, Zn2+.НоосновнымпротеомнымприложениемМАХявляетсяфосфопротеомика,занимающаяся анализом такой посттрансляционной модификации белков какфосфорилирование [45]. Обратимое фосфорилирование белков по остаткам серина,треонинаитирозинаферментативноеконтролируетимеетважноебиологическоезначение.фосфорилирование/дефосфорилированиеключевыевнутриклеточныепроцессы,Какправило,клеточныхбелковсвязанныесделением,дифференцировкой или гибелью клеток.
Активно развиваемая отрасль подобныхисследований – изучение пула модифицированных белков при различных клеточных15состояниях – позволяет вычленять ключевое событие в каскаде фосфорилированийдефосфорилирований.Металл-аффинная хроматография была предложена как относительно простой,экономичныйиуниверсальныйметодвыделенияразличныхтиповфосфорилированных пептидов [47, 48, 49] и быстро нашла свое применение висследованияхфосфопротеома[50,Как51].былоуказановыше,самымираспространенными хелатирующими лигандами в металл-аффинных сорбентахявляются нитрилотриуксусная (NTA) и иминодиуксусная (IDA) кислоты.
Эти кислотыхелатируют ионы Ni2+, Zn2+, Fe3+, Ga3+ и другие [48, 52, 53, 54], при этом свободныеорбитали атомов металлов способны участвовать в координационном взаимодействии сотрицательнозаряженнымипептидами,вчастностисфосфорилированнымипептидами. Было отмечено, что сорбент на основе Fe3+-NTA показывает более высокуюселективность к фосфорилированным пептидам по сравнению с Fe3+-IDA [49]. Однако,серьёзным недостатком метода МАХ является неспецифичное связывание с сорбентомтаких кислых аминокислот, как глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота,гистидин и цистеин, и других отрицательно заряженных соединений.
На протяжениипоследних десятилетий предпринимаются попытки уменьшить неспецифическуюсорбцию различными способами [55]. Так, можно варьировать рН раствора, в которомпроисходит связывание (связывающий буфер) [48, 52] или рН промывочного раствора[53, 54]. Несмотря на успешное применение этого подхода на стандартных белках, припереходе на уровень протеома селективность метода снижается до 60-70%, чтоприводит к недостаточно эффективной идентификации фосфорилированных белков.Альтернативно, возможно использование реакции этерификации для полученияметиловых эфиров пептидов, что позволяет определять большее число сайтовфосфорилирования в сложных биологических смесях [53, 55, 56, 57].
Однако введениедополнительной реакции может привести к большим потерям в образце [58, 59].Недавно были разработаны методики предварительной очистки образцов катионили анионообменной хроматографией [60, 61]. Такой подход позволил увеличитьселективность МАХ до 75%. Однако, к недостаткам такого метода можно отнестивозможностьслишкомгидролизованныхмодифицированныхсильногопептидов,пептидов,аудерживаниятакженапримернеполностьюзначительноеферментативноудерживаниеN-ацетилированныхдругихпептидови16гликопептидов. Кроме того, было показано, что нормальнофазовая хроматография вкачестве предварительного этапа пробоподготовки, может быть эффективна прифосфопротеомной идентификации [62]. Поскольку фосфатная группа является сильногидрофильной, фосфорилированные пептиды слабо удерживаются на нормальной фазе,что приводит, после металл-аффинного обогащения, к 99% селективности.На сегодняшний день наиболее успешным оказалось применение метода МОАХна основе оксида титана TiO2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
