Диссертация (1150381), страница 8
Текст из файла (страница 8)
2.6.4.372.5.4Расчет термодинамических характеристик сорбции пептидовВ микропробирки внесли 20 дм2 МХС Fe(III) или 1 мг МОС Fe(III), добавили 50мкл ацетонитрила, центрифугировали 10 минуты при 10000 об/мин, супернатантотбросили. Затем сорбент промыли 50 мкл 0.1% ТФУ, супернатант послецентрифугирования 10 минут при 10000 об/мин также отбросили. После этого вмикропробирки добавляли 100 мкл раствора пептида SSNGHV(pY)EKLSSI илиFGE(pS)AGAAS с различной концентрацией (10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60мкг/мл).
Сорбцию проводили в течение 24 часов при трех различных температурах:19°С, 29°С и 39°С. Концентрацию пептида после адсорбции определяли по методике2.8.2. Обработку полученных данных производили по п. 2.5.2.2.5.5Определение специфичности сорбции на сорбентахВ микропробирку поместили 20 дм2 МХС Fe(III) или 1 мг МОС Fe(III), промыли50 мкл ацетонитрила, микропробирку центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин,супернатант отбросили. Затем сорбент промыли 50 мкл 0.1 % ТФУ, супернатант послецентрифугирования 10 минут при 10000 об/мин также отбросили. После этого вмикропробиркуссорбентомдобавилипо20мклрастворовпептидовSSNGHV(pY)EKLSSI, FGE(pS)AGAAS и FGESAGAAS (концентрация каждого 1мг/мл) и 60 мкл 0.1 % ТФУ и оставили на 15 минут, после чего микропробиркуцентрифугировали 10 минут при 10000 об/мин. Затем супернатант отобрали в чистуюмикропробирку. К сорбенту добавили 100 мкл 0.1 % ТФУ для промывки, оставили на10 минут, после чего микропробирку центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин исупернатант отобрали, объединили с фракцией проскока и анализировали согласно п.2.8.3.2.6 Металл-аффинная хроматография2.6.1Металл-аффинная хроматография фосфорилированного пептида дляоптимизации десорбцииВ микропробирку поместили 20 дм2 МХС Fe(III), промыли 100 мкл 0.1 % ТФУ,супернатант после центрифугирования 10 минут при 10000 об/мин отбросили.
Послеэтоговмикропробиркуссорбентомдобавили30мклрастворапептида38SSNGHV(pY)EKLSSI (концентрация 1 мг/мл) и 30 мкл 0.1 % ТФУ и оставили на 15минут, после чего микропробирку центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин, затемсупернатант отобрали в чистую микропробирку. К сорбенту добавили 100 мкл 0.1 %ТФУдляпромывки,оставилина10минут,послечегомикропробиркуцентрифугировали 10 минут при 10000 об/мин и супернатант отобрали в чистуюмикропробирку. Элюирование проводили одним из следующих растворителей: 100 мкл0.4М водного аммиака, 100 мкл 0.5 % водного пиперидина, 100 мкл 0.5% фосфорнойкислоты, 100 мкл 15% ПФОС в 0.5 % водном растворе пиперидина, 100 мкл 5%тиоцианата натрия в 0.4 М водном аммиаке, 100 мкл 10% трилона Б в 0.4 М водномаммиаке, 100 мкл 10% перфторгексановой кислоты в 0.5% пиперидине, 100 мкл0.0005% фосфорной кислоты в 0.5% пиперидине с центрифугированием 10 минут при10000 об/мин в каждом случае и с отбором фракций в чистые микропробирки.Здесь и далее запись «15% ПФОС в 0.5% водном растворе пиперидина» означает15%-есодержаниераствораперфтороктановойсульфокислотывметаноле(концентрация 1 мг/мл) в 0.5% водном растворе пиперидина.2.6.2Металл-аффиннаяхроматографиясмесифосфорилированныхинефосфорилированных пептидовВ спиновую колонку поместили 200 дм2 МХС Fe(III) или 5.8 мг МОС Fe(III) или60 мкл PHOS-Select™ Iron Affinity Gel (Sigma Aldrich), промыли 300 мкл 0.1 % ТФУ,супернатант после центрифугирования 10 минут при 10000 об/мин отбросили.
Послеэтого в спиновую колонку с сорбентом добавили по 4 мкл растворов пептидовSSNGHV(pY)EKLSSI, FGE(pS)AGAAS и FGESAGAAS (концентрация каждого 0.1мг/мл) и 50 мкл раствора тау-пептидов в 0.1 % ТФУ (суммарное содержание всехпептидов в смеси составило 4.1 мкг) и оставили на 15 минут, после чего спиновуюколонку центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин, затем супернатант отобрали вчистую микропробирку.
К сорбенту добавили 100 мкл 0.1 % ТФУ для промывки,оставили на 10 минут, после чего спиновую колонку центрифугировали 10 минут при10000 об/мин и супернатант отобрали в чистую микропробирку. Элюированиепроводили последовательно следующими растворителями: 200 мкл 0.4 М водногоаммиака, 200 мкл 0.5 % водного пиперидина, 200 мкл 15% ПФОС в 0.5 % водном39растворе пиперидина с центрифугированием 10 минут при 10000 об/мин в каждомслучае и с отбором фракций в чистые микропробирки.2.6.3Металл-аффинная хроматография триптического гидролизата казеинаВ спиновую колонку поместили 200 дм2 МХС Fe(III) или 5.8 мг МОС Fe(III) или60 мкл PHOS-Select™ Iron Affinity Gel (Sigma Aldrich), промыли 300 мкл 0.1 % ТФУ,супернатант после центрифугирования 10 минут при 10000 об/мин отбросили.
Послеэтого в спиновую колонку с сорбентом добавили раствор триптического гидролизатаказеина в 0.1 % ТФУ (суммарное содержание пептидов 18 мкг) и оставили на 15 минут,после чего спиновую колонку центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин, затемсупернатант отобрали в чистую микропробирку. К сорбенту добавили 100 мкл 0.1 %ТФУ для промывки, оставили на 10 минут, после чего спиновую колонкуцентрифугировали 10 минут при 10000 об/мин и супернатант отобрали в чистуюмикропробирку.Элюированиепроводилипоследовательноследующимирастворителями: 100 мкл 0.4 М водного аммиака, 100 мкл 0.5 % водного пиперидина,100 мкл 15% ПФОС в 0.5 % водном растворе пиперидина с центрифугированием 10минут при 10000 об/мин в каждом случае и с отбором фракций в чистыемикропробирки.2.6.4Металл-аффинная хроматография гидролизата клеточного лизата HeLaВ микропробирку поместили 20 дм2 МХС Fe(III) или 1 мг МОС Fe(III) (либопоместили 80 мкл PHOS-Select™ Iron Affinity Gel (Sigma Aldrich) в спиновую колонку),промыли 50 мкл ацетонитрила, центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин,супернатант отбросили.
Затем сорбент промыли 100 мкл 0.1 % ТФУ, супернатант послецентрифугирования 10 минут при 10000 об/мин также отбросили. После этого вмикропробирку с сорбентом добавили 50 мкл раствора триптических пептидовгидролизата клеточного лизата HeLa в 0.1 % ТФУ (суммарное содержание пептидов 1мкг) и оставили на 15 минут, после чего микропробирку центрифугировали 10 минутпри 10000 об/мин, затем супернатант отобрали в чистую микропробирку.
К сорбентудобавили 50 мкл 0.1 % ТФУ для промывки, оставили на 10 минут, после чегомикропробирку центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин и супернатант отобралив чистую микропробирку. Элюирование проводили последовательно 50 мкл 0.4 М40водного аммиака, 50 мкл 0.5 % пиперидина, 50 мкл 0.5 % триэтиламина сцентрифугированием 10 минут при 10000 об/мин в каждом случае и отбором фракций вчистые микропробирки.2.6.5Металл-аффиннаяхроматографияпептидовмодифицированногозарином альбумина человекаВ спиновую колонку поместили 50 дм2 МХС Fe(III), промыли 50 мклацетонитрила, центрифугировали 2 минуты при 10000 об/мин, супернатант отбросили.Затем сорбент промыли 100 мкл 0.1 % ТФУ, супернатант после центрифугирования 2минуты при 10000 об/мин также отбросили. После этого в спиновую колонку ссорбентом добавили 50 мкл раствора пептического гидролизата сывороточногоальбуминачеловека,модифицированногозарином(концентрация0.1мг/мл,соотношение белок : зарин 2:1 по молям), и оставили на 15 минут, после чего спиновуюколонку центрифугировали 2 минуты при 10000 об/мин, супернатант отбросили.
Ксорбенту добавили 100 мкл 0.1 % ТФУ для промывки, оставили на 10 минут, послечего спиновую колонку центрифугировали 2 минуты при 10000 об/мин и супернатантотобрали в чистую микропробирку. Элюирование проводили 50 мкл 0.5% водногопиперидина, фракцию после центрифугирования 2 минуты при 10000 об/мин отобралив чистую микропробирку для последующего масс-спектрометрического анализа.2.7 Масс-спектрометрический и хроматографический анализ2.7.1Качественный масс-спектрометрический анализ методом МАЛДИМасс-спектрометрический анализ проводили с помощью времяпролетного массспектрометра Axima Perfomance МАЛДИ-TOF-TOF с источником ионов МАЛДИ,оснащенном УФ-лазером (337 нм).
Режим детектирования положительных ионов сиспользованием рефлектрона при следующих настройках ионного источника:напряжение 20 кВ, напряжение на линзах (lens) 6.5 кВ, напряжение на рефлектроне(Ref) 24.38 кВ. Ионы детектировали в диапазоне m/z от 280 до 5000. Масс-спектрырегистрировали при помощи программы МАЛДИ-MS Shimadzu Biotech (Shimadzu,Япония).
Калибровку в режиме отрицательных ионов проводили по масс-спектру смесипептидов: дипептид YR [М-Н]- 336.18 Да и YAGFLR [М-Н]- 724.39 Да. Калибровку врежимеположительныхионовпроводилипомасс-спектрусмесипептидов:41ангиотензин 2 (МН+ 1046.542 Да), ангиотензин 1 (МН+ 2296.685 Да), N-ацетилренин(МН+ 1800.943 Да), аденокортикотропный гормон (1-17) (МН+ 2093.086 Да).2.7.2Количественный хроматографический анализ методом ВЭЖХ-УФА) Режим изократического элюирования.
Хроматограф Shimadzu LC-20«Prominence» с УФ детектором с диодной матрицей SPD-M20A, рабочая длина волны210 нм. Колонка Acsentis C18 (4.6 х 250 мм). Состав подвижной фазы: компонент А –7.6 мМ ацетат аммония в 0.1 % водном растворе ТФУ, компонент В – 100%ацетонитрил, соотношение компонентов А:В – 40:60 (% об.). Скорость потокаподвижной фазы: 1.0 мл/мин. Колонку термостатировали при 45°С. Объем вводимой вхроматограф пробы составлял 20 мкл.Б)Режимградиентногоэлюирования.ХроматографShimadzuLC-20«Prominence» с УФ детектором с диодной матрицей SPD-M20A, рабочая длина волны210 нм. Колонка Supelcosil C18 (4.6 × 250 мм). Состав подвижной фазы: компонент А –7.6 мМ ацетат аммония в 0.1 % водном растворе ТФУ, компонент В – 100%ацетонитрил, режим элюирования – градиентный: от 5 % В до 50 % В (0 – 7 мин), от 50% В до 80 % В (7 – 10 мин), от 80 % В до 5 % В (10 – 12 мин).
Скорость потокаподвижной фазы 1.0 мл/мин. Колонку термостатировали при 45°С. Объем вводимой вхроматограф пробы составлял 20 мкл.Содержание пептида в проскоке определяли относительно стандартногораствора с учетом известного внесенного количества и разбавления в ходе анализа.2.7.3Количественный хромато-масс-спектрометрический анализ методомВЭЖХ-МСКоличественный анализ проводили на ВЭЖХ-МС системе, состоящей изжидкостного хроматографа Waters Alliance 2695 с масс-спектрометром PE Sciex APIQSTAR (ионизация методом электроспрей). Хроматографическая колонка PhenomenexC18 (2 х 150 мм, 3 мкм, 125 Å). Подвижная фаза: компонент А – 0.1% водный раствормуравьиной кислоты, компонент В – 0.1% раствор муравьиной кислоты вацетонитриле, режим элюирования – градиентный: 3% В (0 – 5 мин), от 3 % В до 43 %В (5 – 35 мин), от 43 % В до 95 % В (35 – 38 мин), 95% В (38 – 42 мин).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
