Диссертация (1150381), страница 4
Текст из файла (страница 4)
При использовании предколонки с TiO2, соединенной собращенно-фазовой капиллярной колонкой, авторами [63] была показана возможностьизвлечения фосфорилированных пептидов казеина из гидролизата суммарного белкамолокакоровы.Однакоселективностьэтогометодабыласниженаиз-занеспецифического связывания кислых нефосфорилированных пептидов. В работе [64]авторы использовали 2,5-дигидроксибензойную кислоту в качестве добавки в раствор,в котором проходит сорбция, для удаления неспецифично связавшихся пептидов, чтоповысило селективность и чувствительность метода.
В работе [65] была впервыепоказана возможность применения оксида циркония при МОАХ, причем ZrO 2 имеетбольшую селективность к монофосфорилированным пептидам, тогда как TiO 2 – кмультифосфорилированным. Был сделан вывод, что комбинация двух сорбентов имеетпотенциал для исчерпывающего профилирования фосфопротеома [66]. При добавлениив связывающий и промывочный буферы молочной кислоты, в элюате после МОАХ наTiO2 содержится, как правило, более 90% фосфорилированных пептидов, для ZrO2 этозначение ниже [67].Сорбенты на основе оксидов металлов могут быть использованы в различномаппаратурномобеспечивающийисполнении.гибкостьвНаиболеераспространенподборерастворителей«off-line»ивариант,масштабируемостиэксперимента. Частицы оксидов металлов могут быть упакованы в носики дляавтоматических пипеток (сорбция достигается путем многократного пропусканияобразца через сорбент) [68], либо помещены в спиновые колонки (образец пропускаютчерез сорбент с помощью центрифуги).
Альтернативно возможен batch-вариант, вкотором сорбент помещен в микропробирку, что позволяет веществу дольшевзаимодействовать с ним. В «on-line»-режиме оксиды металлов помещают впредколонки для ВЭЖХ-систем [69].17Недавно появились разработки наночастиц на основе оксидов металлов, вкоторых на наноразмерные магнитные шарики или на полимерную подложку наносяттонкий слой оксида [70, 71]. Такая структура обладает большой удельнойповерхностью и повышенной сорбционной емкостью по сравнению с традиционнымиметалл-аффинными сорбентами, однако, есть сомнения по поводу воспроизводимоститаких структур.
Также имеются сведения о создании модифицированных сорбентамимишеней для МАЛДИ-масс-спектрометрии [72, 73].Сравнение методов МАХ и МОАХ вызывает все больший интерес. Так, былопоказано [67], что оксид титана более устойчив к влиянию солей, детергентов и малыхмолекул, чем классические металл-аффинные сорбенты. Добавление детергента всвязывающий буфер может увеличить производительность МАХ из-за уменьшенияадгезиинаповерхностимикропробирок,и,болеетого,благоприятствоватьобогащению мультифосфорилированных пептидов по сравнению с TiO2. Авторы [74]показали новый подход – последовательное элюирование с сорбента для разделениямоно- и мультифосфорилированных пептидов при варьировании элюентов.
ПосравнениюспроточнымпродемонстрировалвариантомпрекраснуюМОАХ,степеньbatch-анализизвлеченияи(впробирке)моно-,имультифосфорилированных пептидов. Таким образом, экспериментальные условиясильно влияют на производительность и селективность МАХ. Масштабное сравнениеМАХ и МОАХ TiO2 при профилировании фосфопротеома клеток Drosophilamelanogaster Kc167 было проведено авторами [75]. МАХ с предварительнымметилированием пептидной смеси продемонстрировала 80% селективность, так же, каки МОАХ. Особенно важно небольшое перекрывание результатов идентификациифосфорилированных белков (35%), что говорит о возможности комбинирования двухметодов для более полного профилирования. Авторы работы [76] использовалипоследовательное элюирование 5% водным аммиаком, 5% пиперидином и 5%пирролидином,чтосущественноувеличилочислоидентифицированныхфосфорилированных белков к клеточной линии HeLa.Широкоеразвитиехромато-масс-спектрометрическихметодоввфосфопротеомике привело к возможности изучения и решения таких фундаментальныхзадач в биологии, как передача сигналов в клетках и механизм их регулирования, атакже исследование различных заболеваний, при которых меняется качественный и18количественный состав фосфорилированных белков, и другие биохимические задачи.Обратимый процесс фосфорилирования/дефосфорилирования белков чрезвычайноважен для проведения межклеточных сигналов.
Нарушение сигнальных системприводит к таким тяжелым заболеваниям, как диабет [77, 78], рак [79], болезньАльцгеймера [79, 80], сердечная недостаточность [80] и многие другие.Поскольку клеточные сигнальные системы, в которых большую роль играютфосфорилированные белки, существуют практически во всех живых системах, включаявысокоразвитые организмы, фосфопротеомные исследования таких систем имеютогромноезначение.Например,применениеМОАХTiO2дляобогащенияфосфопептидов позволило установить типы киназ, задействованных в развитииэмбрионов рыбы данио-рерио [81].Фосфорилирование белков в тканях мышей (мозг, сердце, печень и пр.) былоизученосприменениемметалл-аффинногосорбента,содержащегожелезо(идентифицировано 12000 белков и 36000 сайтов фосфорилирования) и позволило, вопервых, установить специфичность фосфорилирования в различных тканях, во-вторых,определить активность нескольких киназ, что позволило авторам в конечном итогесоздать атлас фосфобелков мыши [82].Важной областью биомедицины, в которой задействована фосфопротеомика,является изучение стволовых клеток, а именно понимание сигнальных механизмов вних.
В работе [83] рассмотрены протеомный и фосфопротеомный (с использованиемкомбинации ион-обменной хроматографии и МОАХ TiO2) ответ стволовых клетокчеловеческих эмбрионов при дифференцировании. А в работе [84] приведены данныеоб 10844 сайтах фосфорилирования белков стволовых клеток. Эти данные помогаютустановить природу уникальности стволовых клеток.В последние годы активно развивается направление, связанное с анализомпосттрансляционныхмодификацийбелковразличнымитоксикантамииксенобиотиками, которое получило собственное название – «аддуктомика», в рамкахкоторого методы МАХ и МОАХ также нашли свое применение. Особое вниманиеуделяется аддуктам белков крови (бутирилхолинэстеразы (БХЭ) и сывороточногоальбумина) с фосфорсодержащими соединениями, в том числе и с отравляющимивеществами, такими как зарин и зоман [85, 86].
Причем, зачастую можно обнаружитьнесколько сайтов модификации альбумина фосфорорганическими соединениями.19Возможность обогащения образцов аддуктами пептидов сывороточного альбуминаметодом МАХ на сорбенте с иммобилизованными ионами железа(III) была показана напримере параоксона [86]. Авторы работы [87] успешно идентифицировали пептидысывороточного альбумина человека, модифицированные зарином и зоманом, после ихвыделения из образца с помощью TiO2. Кроме того, авторами [88], была показанапринципиальная возможность применения металл-аффинной хроматографии дляспецифичной сорбции алкилированных аддуктов сернистого иприта с глобином насорбенте, содержащем ионы Cu2+.Таким образом, металл-аффинная хроматография является специфичным инадежным методом пробоподготовки.
Несмотря на относительно недолгую историюсуществования,методполучилбыстроеразвитиевомногихнаправленияхбиоорганического анализа, и в последние годы круг задач, решаемых с помощью МАХи МОАХ, стремительно расширяется. В ближайших перспективах можно ожидать, чтометод будет широко использоваться в ретроспективном токсикологическом анализе,для разработки новых методов диагностики различных заболеваний, производственовых лекарственных препаратов.1.2 Фосфопротеомный масс-спектрометрический анализКак описывалось выше, фосфорилирование белков является одним из наиболеераспространенных механизмов биологической регуляции, известно о его участии вметаболизме, транскрипции ДНК, разрушении белков, гомеостазе, сигнальных иобменных процессах в клетке [98].
В связи с этим, чрезвычайно важной задачейявляется разработка аналитических подходов по характеризации значимого числафосфорилированных белков; выполнение этой задачи усложняется малым инепостоянным содержанием фосфобелков в биологическом материале [99].Фосфопротеомный анализ включает в себя следующие стадии [100]:1) Из биологического материала (кровь, клеточный лизат и другие) извлекаютбелки.2) Полученные белки подвергают ферментативному гидролизу для полученияпептидов предсказуемого состава.3) Фосфорилированные пептиды выделяют для повышения их содержания впробе.204) Проводят масс-спектрометрический анализ пептидов, с последующейпрограммной обработкой полученных результатов.Современная масс-спектрометрия является общепризнанным и надежнымметодом как качественного, так и количественного (в сочетании с высокоэффективнойжидкостнойхроматографией)анализамногокомпонентныхпептидныхсмесей.Ключевым этапом пробоподготовки к фосфопротеомному анализу является п.
3 из-занизкого (на 5-6 порядков ниже относительно немодифицированных пептидов)содержания фосфорилированных пептидов в образце. Среди методов обогащенияпробы фосфорилированными пептидами известны: Радиоактивное мечение при помощи32Р-АТФ с последующим гель-электрофорезом или тонкослойной хроматографией. Метод неэффективен из-заневозможности получать достаточное большое количество белка на анализ [101]. Химическая дериватизация пептидной смеси (например, О-метилированиеилинесколькопоследовательныхпревращений)может[102]привестикнепредсказуемым и неидентифицируемым продуктам реакции. Катионобменнаяотрицательнохроматографиязаряженнойселективности,из-зафосфорнойналичиявразделяетгруппы,пептидахчтопептидынедругихпоприводитотрицательнопризнакуквысокойзаряженныхфункциональных групп [103, 104, 105]. Аффинноеобогащение(иммунопреципитация)сиспользованиемфосфоспецифичных антител, наиболее изучены антифосфотирозиновые антитела [106,107].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
