Диссертация (1150240), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Образование комплексасопровождается изменениями в УФ-спектре (рис.1.20) и статическим тушениемфлюоресценции (из спектров флюоресценции рассчитаны константы связыванияи термодинамические параметры связывания, по которым определялис ь видывзаимодействия гемоглобина и коллоидными частичками оксидов железа).Авторы считают, что при рН=7,4 бычий гемоглобин (рНИЭТ =6,8) и смесь оксидовжелеза (рНИЭТ =6,5), заряжены отрицательно, поэтому электростатическоевзаимодействие будет незначительным [57].Во многих областях применения порфиринов выгодно использоватьпорфирины, адсорбированные на твердой подложке, в том числе дляферментативного катализа [1], фотосенсибилизаторов и химических реакций [3,11] молекулярной электроники, поэтому довольно много работ посвященоадсорбции порфиринов на различных поверхностях [64-67], образованиюнаночастиц [68-69], формированию и свойствам порфириновых пленок [70-73].
Вработе [65] исследуется адсорбция одного из представителей порфиринов (meso tetra(4-N,N,N-trimethylanilinium)porphine) в зависимости от рН на природноммонтмориллоните (глине), содержащий натрий. В слегка кислой и нейтральнойобласти порфирин на поверхности образует агрегаты. Показано, что на глинеадсорбируется преимущественно протонированная форма порфирина (по сдвигуполосв спектрах поглощения). На приборе Zetasizer был исследованэлектрокинетический потенциал глины в буферных растворах с различным рН безпорфирина и в присутствии порфирина.
При рН 4,5 порфирин в больших- 44 -количествах адсорбируется на поверхности и вызывает изменение зарядаповерхности глины (таблица ХI). Авторы предполагают, что такое изменениезаряда может быть результатом переориентации протонированного порфирина, нележащего плоскостью кольца на поверхности.Рис. 1.20 УФ-спектр гемоглобина в присутствии коллоидного Fe3O4 (А),только гемоглобина (B) и разность между адсорбционными спектрами А и В.(Спектры сняты при pH 7.40 в трис-соляном буфере (0.05M трис, 0.1M NaCl),концентрация гемоглобина-3 ммоль/л, Fe3O4 -2.870·10−2 ммоль/л).Одним из наиболее масштабных направлений является исследованиеадсорбции билирубина различными адсорбентами (примеры - [74-75]).
Интерес кэтим исследованием обусловлен тем, что высокие концентрации билирубина(гипербилирубинемия) приводят к повреждению тканей, влияют на нервнуюсистему, негативно сказываются на иммунном ответе организма, поэтому егоудалению из организма уделяется особое внимание. Для удаления билирубинаможно использовать адсорбционные, электрохимические и фотохимическиеметоды [5, стр.
98]. Адсорбционные методы используютсядля удалениябилирубина как напрямую из плазмы крови (например, "hemoperfusion treatment"- 45 -в колонках с различными адсорбентами: активированным углем, агаром,синтетическими волокнами, альбумином, посаженным на макросетчатые смолы,полиакриламидом,полилизинана хитозановых сферах,стирен-дивинил-бензоловыми смолами, poly-EGDMA-HEMA микросферами и др.
[76-78]), так ииз водных растворов [74]. Показано, что для адсорбции билирубина лучшеподходят полярные адсорбенты [79]. Поскольку в организме билирубин можетнаходиться в свободном состоянии или быть связанным с альбумином, то вомногих работах, посвященных адсорбции билирубина встречаются адсорбенты,модифицированные альбумином [77, 80] либо проводится сравнительноеисследование адсорбции билирубина и альбумина [79].В работе [75]приисследовании адсорбции на ацетат целлюлозной/полиэтилениминой мембране какдоказательство возможности образования комплекса дезоксихолат натрияальбумин-билирубиниспользуютспектрыпоглощениясвета,круговогодихроизма и изменение электрокинетического потенциала.Исследование адсорбции гемоглобина являются не столь значительными и влитературе по сравнению с адсорбцией билирубина встречаются гораздо реже.Гемоглобин является токсичным только в больших количествах в свободномсостоянии (большая часть гемоглобина у человека находится в эритроцитах).Однако, например, при использовании реинфузии (переливание пациентусобственной крови) в результате разрушения эритроцитов образуется избытоксвободного гемоглобина.Российские ученые предлагают для уменьшения егоколичества использовать сорбенты, созданные путем модификации полипирроломили ионами меди активированного угля [81-82].Порфирины и их аналоги, благодаря важным биологическим функциям иобширной области применения, вызывают большой интерес.
Гемоглобин ибилирубин являются основными компонентами биологических дисперсныхсистем животного происхождения, хлорофилл – растительного, а коллоидныесвойстваихводныхдисперсийвзначительноймереопределяютжизнеспособность живого организма. Анализ литературы показывает, чтоимеющиеся данные по коллоидной химии тетрапирролов весьма ограничены,- 46 -разрозненны и не позволяют достаточно надежно объяснять наблюдаемыеявления. В связи с отмеченным, цель диссертационной работы состоит вустановлениизакономерностейгемоглобина,билирубинаиколлоидныххлорофиллаэлектролитов и простейших аминокислот.свойстввводныхрастворахдисперсийнеорганических- 47 -2 Объекты и методы исследования2.1 Объекты исследованияВ настоящей работе в качестве объектов исследования использовалисьводные дисперсии природных биологически активных веществ - билирубина,гемоглобина, хлорофилла. Изучение коллоидных свойств водных дисперсий этихвеществ проводилось в зависимости от состава дисперсионной среды (рН,присутствие различных ионов, аминокислот).
Для приготовления дисперсионнойсреды использовались водные растворы различных электролитов и аминокислот,приготовленные на бидистиллированной воде. В качестве электролитов быливыбраны те вещества, ионы которых в больших количествах содержатся в крови идругих физиологических жидкостях (кроме цитрат-ионов1): соляная кислота,хлорид калия, хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид магния, карбонат калия,сульфаты железа II и III, фосфорная кислота, дигидроортофосфат калия,гидроортофосфат натрия, сульфат калия, цитрат натрия, лимонная кислота,гидроксидкалия.Вкачествеаминокислотиспользовалисьглициниаспарагиновая кислота компании Sigma-Aldrich (рис. 2.1, 2.2). Предложенныеаминокислоты являются важнейшими органическими лигандами, так как атомыазота и кислорода в их молекулах обладают неподеленными электроннымипарами (представляют собой доноры электронов).
Глицин и аспарагиноваякислота имеют одну аминогруппу и отличаются количеством карбоксильныхгрупп. В растворах аминокислоты находятся в катионной, анионной и цвиттерионной форме. Все используемые для приготовления дисперсионной средывещества имеют квалификацию ХЧ.Цитрат натрия 1-замещѐнный используют для консервирования крови, чтобы связать большуючасть ионов кальция. Без ионов кальция кровь дольше хранится, не происходит коагуляции –слипания эритроцитов и других клеток крови .1- 48 -Рис. 2.1 ГлицинРис.
2.2 Аспарагиновая кислота2.1.1 Приготовление дисперсий гемоглобиновВ работе использовались три вида гемоглобина: бычий, лошадиный игемоглобин человека.Бычий гемоглобин (hemoglobin from bovine blood), выделенный иочищенныйкомпаниейFlukaAnalytical,Швеция,предназначендлямикробиологии, имеет молекулярную массу 64500 г/моль (размер молекулы - 6,4нм). На воздухе быстро окисляется, поэтому производитель предупреждает о том,чтопри егоприготовлении,особенно при нагреве, может оказатьсяпреимущественно метгемоглобин (железо находится в трехвалентном состоянии).В связи с этим хранился в плотно упакованной таре в холодильнике.
Состоит изсмеси гемоглобинов HBA1(281221), HBB(280813), HBE2(513240), HBE4(513108),HBG(511735), alpha globin (512439).Лошадиный гемоглобин (Hemoglobin, equine) произведен компанией SigmaAldrich Chemie GmbH - лиофилизированный красно-коричневый порошок(молекулярная масса 64500 г/моль), также хранится при низких температурах.Человеческий гемоглобин (hemoglobin human) произведен компаниейSigma-Aldrich Chemie GmbH, темно-коричневый порошок с содержанием воды 6% и железа - 0,31 % (молекулярная масса 64500 г/моль).
Хранится при тех жеусловиях. Состоит из смеси гемоглобинов HBA1(3039), HBA2(3040), HBB(3043),HBD(3045), HBE1(3046), HBG1(3047), HBG2(3048), HBQ1(3049), HBZ(3050).В работе для микроэлектрофореза и фотометрии использовалась 0,1%дисперсиягемоглобина,для потенциометрического титрования- 0,2%,приготовленная следующим образом: навеска гемоглобина растиралась в ступке внебольшом количестве исследуемого раствора до образования густой пасты,затем добавлялся весь объем раствора.- 49 -2.1.2 Приготовление дисперсий билирубинаБилирубин произведен ЗАО "Вектон".
Имеет квалификацию Ч, содержит0,5%сульфатови не более 0,5% нерастворимых веществ. В работеиспользовалась для микроэлектрофореза и фотометрии 0,01% дисперсиябилирубина, для потенциометрического титрования -0,2%, приготовленнаяследующим образом: навеска билирубина растиралась в ступке в небольшомколичестве исследуемого раствора до образования густой пасты, затем добавлялсявесь объем раствора.2.1.3 Приготовление дисперсий хлорофиллаВ качестве источника хлорофилла для работы использовалась БАД"Хлорофиллипт" компании Arterium, содержащий смесь хлорофиллов а и b до 1мг (из 10 мг экстракта хлорофиллипта) на 1 мл спиртового раствора.Чистый хлорофилл выделялся многократной экстракцией хлорофиллипта вводе.
При этом хлорофилл из водно-спиртовой смеси осаждался в центрифуге счастотой 3000 оборотов секунду в течение 10 минут. Степень очистки хлорофиллаконтролировали по изменению поверхностного натяжения водных дисперсийхлорофилла. Отмывку проводили до установления постоянного значенияповерхностного натяжения. Измеряли поверхностное натяжение полученныхрастворов на тензиометре (результаты расчетов представлены в табл. 2.1).Параллельно проводилось измерение электрокинетического потенциалахлорофилла в водных дисперсиях в зависимости от степени очистки (рис.2.3).Видно, что значения электрокинетического потенциала устанавливались уже навторой экстракции.очистки.В работе использовался хлорофилл после трехкратной- 50 -Таблица 2.1Значения поверхностного натяжения для водных экстрактов хлорофиллаВеществоПоверхностное натяжение, 10-3 Дж/м2ВодаПервая экстракцияВторая экстракцияТретья экстракцияЧетвертая экстракция72,743,856,861,361,6ζ, мВ15-10 2345-35рН123-60Рис.
2.3 Зависимость электрокинетического потенциала хлорофилла от рН вводных растворах хлорида калия 5·10-4 моль/л в зависимости от количестваэкстракций: 1 - однократная экстракция, 2 - двукратная, 3 - трехкратная.Для микроэлектрофореза использовалась водная дисперсия хлорофилла0,0024 %, а для потенциометрического титрования - 0,04 %.2.2.Методы и методики исследованияИзучение устойчивости водных дисперсий билирубина и гемоглобинапроводилось фотометрическим методом. Для исследования адсорбционныхсвойствхлорофилла,билирубинаи гемоглобина вводных растворахиспользовался метод потенциометрического титрования.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
