Диссертация (1150240), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Методикакондуктометрического титрованияКондуктометрические исследования выполнялись на кондуктометреHanna HI 8733. 20 мл исследуемой дисперсии БАВ через час послеприготовления помещались в ячейку для кондуктометрического титрования(рис. 2.6), выдерживались не менее 30 минут в атмосфере азота и затемтитровались раствором KOH (0,025 моль∙л-1) или HCl (0,01 моль∙л-1). Титрантдобавлялся порциями по 0,1 мл с интервалом в 30 секунд и регистрировалисьзначения удельной электропроводности на кондуктометре. Точность измеренияудельной электропроводности æ составила ±0,1%. По полученным даннымстроились зависимости удельной электропроводности от объема добавленноготитранта.
Исходя из точек перегиба полученных зависимостей, рассчитывалоськоличество кислотных групп (по результатам титрования щелочью) и основных(по результатам титрования кислотой).12Азот345Рис.2.6 Ячейка для кондуктометрического титрования: 1 - подвод титранта измикробюретки для титрования; 2 - электрод кондуктометра; 3 - трубка дляподвода газа; 4 - ячейка с раствором; 5 - стерженек магнитной мешалки.- 58 -2.2.5 Измерение вязкости водных дисперсий гемоглобинаВязкость определялась на капиллярном вискозиметре Оствальда.
Течение вкапилляре вискозиметра происходит под действием суммы гидростатического ивнешнего давления. Гидростатическое давление возникает за счет столбикажидкости в вискозиметре, а внешнее подается в систему нагнетателем иизмеряется манометром в см водного столба.Исследованиевлияниявнешнегодавлениянатечениежидкостиосуществляют с помощью специальной установки, схема которой показана нарис.
2.7. В вискозиметр 10 наливается 10 мл дистиллированной воды илидисперсии гемоглобина. Измеряют время истечения воды/дисперсии гемоглобиначерез капилляр при пяти различных внешних давлениях (в пределах 10–90 смводного столба). Для этого закрывают кран 6 и создают нагнетателем 1 вбуферном баллоне требуемое внешнее давление Рвн.
Давление измеряют спомощью манометра 3 в миллиметрах водного столба. Открывают кран 6,передавая давление Рвн из буферного баллона на жидкость в вискозиметре.Дождавшись момента прохождения жидкостью верхней риски, включаютсекундомер, который выключают при прохождении жидкостью нижней риски.Измерения проводят при пяти различных давлениях. После измерения времениистечения закрывают кран 6 и сбрасывают давление, открывая кран 7.Общее давление в системе (разность давлений на концах капилляра)Р= Pвн+ Pг(2.4)где Рг - среднее гидростатическое давление, Па, а Pвн - внешнее давление,приложенное к системе, Па.Среднее гидростатическое в вискозиметре рассчитывают по формуле:Pг g (a b)/2 =(165+127,5)·9,81/2=1434,713 Па(2.6)где g = 9,81 м /с 2 – ускорение силы тяжести; ρ = 1000 кг/м3 – плотностьжидкости h = (а+b)/2 - средняя высота столба жидкости в вискозиметре, м, а и b расстояния от поверхности жидкости в вискозиметре до нижней и верхней риски.Внешнее давление рассчитывается по формуле:- 59 -Рвн = ∆P·10=(P н+Pв)·10(2.7)где ∆P=P н+Pв - разность уровней жидкости в манометре, дел., Рн, Рв - нижнееи верхнее отклонение границы жидкости в манометре от нулевой метки, см вод.столба, 10 - коэффициент для пересчета см водяного столба в Па.6587249101113Рис.
2.7 Установка для исследования влияния внешнего давления на вязкостьжидкости: 1 – нагнетатель; 2, 5, 8 – соединительные шланги; 3 – манометр; 4,6, 7 – краны; 9 – термостат; 10 – вискозиметр; 11 – буферный баллон.2.3 Погрешности экспериментальных данныхПогрешности методик рассчитывалисьпоследующему алгоритму,используя статистические методы обработки наблюдений [93-94].Находили среднее арифметическое результатовдля серии из Nнаблюдений:NХ Xn 1n(2. 8)NN(или среднее геометрическое Х N X n )n 1Рассчитывали дисперсию для одного измерения:(2.
9)- 60 N(X XS n 12n)(2.10)N 1Или для трех параллельных измеренийS 2mnj 1i 1 (Xj X ij )nm(2.10.1)где n - общее число проб, m - число параллельных измерений [94]Находили среднеквадратичное отклонение Sn:Sn S 2(2.11)Вычисляли погрешность измерений при доверительной вероятности р =0.95: 1S n 100%Х(2.12)где – коэффициент Стьюдента, учитывающий ограниченность выборки.Для расчета погрешности были сделаны 20 проб, для которых проводилосьпо 3 параллельных измерения: количество проб (N) равнялось 20, соответственнокоэффициент Стьюдента = 2,2622. Для расчетов по формулам 2.18-2.21использовались встроенные функции программы Excel.Погрешность измерений -потенциала методом микроэлектрофореза вдиапазоне 10 – 50 мВ составила ±10%, а в диапазоне 0 – 10 мВ ±30%.Случайная погрешность адсорбции (Г) составила 1%. Общая погрешность, сучетом погрешности методики, не превысила 5%.Погрешность измерения рН составляла ± 0.02 единицы рН. Погрешностьизмерения рН изоэлектрической точки и точки нулевого заряда составила ±0,1 ед.рН (определялось среднее арифметическое отклонение рНИЭТ/ТНЗ по результатам3х опытов).Погрешность фиксированных значений λ в спектрофотометрическихисследованиях составила ± 0,1 мкм.- 61 -3 Результаты и их обсуждение3.1 Коллоидные свойства водных дисперсий гемоглобина3.1.1 Кинетика установления адсорбционного равновесияВ связи с тем, что гемоглобин имеет сложную структуру, его взаимодействиес водным раствором и веществами, содержащимися в нем, носит непростойхарактер.
При контакте гемоглобина с водным раствором происходит рядвзаимосвязанных процессов: частичная диссоциация его функциональных групп,адсорбция на поверхности гемоглобина веществ из раствора, набухание,перераспределение связей между полипептидными цепочками и изменениеконформации молекулы. Время установления адсорбционного равновесия можноопределять по времени, за которое устанавливаются постоянные значенияпараметров дисперсной фазы или дисперсионной среды. С целью определениявремени адсорбционного равновесия проведены исследования зависимостиэлектропроводности, рН, электрокинетического потенциала от времени контактафаз.
Примеры этих зависимостей для лошадиного и бычьего гемоглобина впредставлены на рис. 3.1-3.5 и в таблицах Приложения А1, А2.æ,мкCм/смæ, мкCм/см27550484644265t, ч02550Рис. 3.1 Зависимость значенийt, ч255050100Рис. 3.2 Зависимость значенийудельной электропроводности водных удельной электропроводности водныхдисперсий бычьего гемоглобина отдисперсий лошадиного гемоглобинавремени контакта фаз вот времени контакта фаз в растворедистиллированной воде.НСl 1·10-3 моль/л.- 62 -ζ, мВ605040t, ч30020406080100Рис.
3.3 Зависимость значений электрокинетического потенциала водныхдисперсий лошадиного гемоглобина от времени контакта фазв растворе НСl 1·10-3 моль/л.рНрН7,253,67t, ч6,75t, ч3,405010002550Рис. 3.4 Зависимость значений рНРис. 3.5 Зависимость значений рНводных дисперсий лошадиноговодных дисперсий лошадиногогемоглобина от времени контакта фаз гемоглобина от времени контакта фазв дистиллированной воде.в растворе НСl 1·10-3 моль/л.Как видно из рис. 3.1 электропроводность дисперсии гемоглобина в водеувеличивается,чтопроисходитвследствиечастичнойдиссоциациифункциональных групп гемоглобина. В кислой среде (рН около 3,5) преобладаетадсорбцияпротоновнаэлектропроводности (рис.
3.2).гемоглобине,чтовызываетуменьшение- 63 -Анализполученныхзависимостейпоказывает,чтоадсорбционноеравновесие в системе устанавливается менее, чем за 10 часов. Для удобства вседальнейшие измерения проводились при времени контакта фаз – 24 часа.3.1.2 Зависимость электрокинетического потенциала лошадиногогемоглобина от рН и ионной силы раствораРассмотрим зависимость электрокинетического потенциала лошадиногогемоглобина от рН и ионной силы раствора (рис.
3.6, таблица Приложения А3).Нулевому значению электрокинетического потенциала соответствует рН ИЭТ (рНизоэлектрической точки). Как видно из рис. 3.6 значение рН изоэлектрическойточки лошадиного гемоглобина составляет 6.3. При значениях рН, меньших 6.3,электрокинетический потенциал положителен вследствие адсорбции ионовводорода, а при больших значениях- отрицателен из-за адсорбции ионовζ, мВ501252рН03579-25гидроксила.-50Рис.3.6 - Зависимость электрокинетического потенциала водных дисперсийлошадиного гемоглобина от рН в растворах КСl:1 – концентрация КСl 510-3 моль/л, 2 - 110-3 моль/л.- 64 -Ионная сила раствора влияет на электрокинетический потенциал всоответствии с классической теорией ДЭС: увеличение ионной силы раствора(концентрации хлорида калия)электрическогослоя,вызывает сжатие диффузной части двойноговследствиечегоуменьшаютсязначенияэлектрокинетического потенциала.3.1.3 Сравнение зависимостей электрокинетического потенциала от рН дляразличных видов гемоглобинаПонятие гемоглобин применяется не для конкретного соединения, а длягруппы очень схожих по строению гемпротеинов.
Как уже описывалось ранее,гемоглобины различаются аминокислотным составом белковой части молекулы,определяемым генетическими факторами (только у человека имеется нескольковидов нормальных гемоглобинов).Последовательности аминокислот уразличных видов животных неодинаковы, что отражается в растворимости,изоэлектрической точке, сродстве к кислороду и устойчивости изолированныхпигментов к кислотам, щелочам и нагреванию [30-31], изменении максимумовпоглощения света (изменение адсорбционных спектров бычьего гемоглобина посравнению с человеческим гемоглобином представлено на рис. 1.10 (глава "1.3Гемоглобин")).Рассмотрим, какое влияние оказывает изменение структуры белковой частина электрокинетический потенциал гемоглобина (рис.