Диссертация (1145903), страница 23
Текст из файла (страница 23)
32.а - макрофаги инкубировали в присутствии 100 мкг/мл моликсана в номинальнобескальциевой среде, затем вход Са2+ индуцировали введением в наружную среду 2 мМ Са2+.Во время входа Са2+ вводили 100 мкМ проадифена.б - клетки инкубировали с 100 мкМ проадифена в течение 5 мин в бескальциевой средедо введения 100 мкг/мл моликсана. Через 20 мин инициировали вход Са2+ введением 2 мМ Са2+.126Рис.
48. Влияние эконазола на Са2+-ответы, вызванные моликсаном вперитонеальных макрофагах крысыПо вертикали и по горизонтали – то же, что на рис. 32.а – макрофаги инкубировали со 100 мкг/мл моликсана в номинально бескальциевойсреде, затем вход Са2+ индуцировали введением в наружную среду 2 мМ Са2+. Во время входаСа2+ вводили 5 мкМ эконазола.б – клетки инкубировали с 5 мкМ эконазола в течение 5 мин в бескальциевой среде довведения 100 мкг/мл моликсана.
Через 20 мин инициировали вход Са2+ введением 2 мМ Са2+.127Эти результаты согласуются с более ранними данными о влиянии ингибиторовэпоксигеназ эконазола и проадифена на [Ca2+]i в перитонеальных макрофагах крысы(Крутецкая, Лебедев, 1998; Крутецкая и др., 2000, 2003) и клетках аденокарциномы прямойкишки линии HT29 (Carrillo et al., 2013). Так, ранее было показано, что проадифен и эконазолвызывают двухфазное увеличение [Ca2+]i, связанное с мобилизацией Са2+ из внутриклеточныхтапсигаргин-чувствительных Са2+-депо и последующим входом Са2+ в перитонеальныемакрофаги крысы (Крутецкая, Лебедев, 1998; Крутецкая и др., 2000, 2003).
Кроме того,учитывая относительно медленную кинетику высвобождения Са2+ из депо при действииэконазола и проадифена, можно предположить, что антимикотические агенты увеличивают[Ca2+]i, ингибируя Са2+-АТФазы в мембране Са2+-депо (Крутецкая, Лебедев, 1998; Крутецкая идр., 2000, 2003). В пользу этого предположения свидетельствуют данные о том, чтоимидазольные соединения, наряду с тапсигаргином, циклопьязониковой кислотой и BHQ,ингибируют Са2+-ATФазы в мембране саркоплазматического ретикулума (Mason et al., 1993;Snajdrova et al., 1998).В связи с этим можно предположить, что подавление проадифеном и эконазоломмобилизации Са2+ из депо, индуцированной глутоксимом или моликсаном, может быть связанос тем, что к моменту введения глутоксима или моликсана депо уже были частично опустошеныприложением проадифена или эконазола.Рис.
49. Влияние проадифена на внутриклеточную концентрацию Са2+ вперитонеальных макрофагах крысыПо вертикали и по горизонтали – то же, что на рис. 32.Клетки инкубировали 11 мин с 100 мкМ проадифена в номинально бескальциевой среде,затем инициировали вход Са2+ введением в наружную среду 2 мМ Са2+.128Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что одним из важныхучастников сигнального каскада, запускаемого глутоксимом и моликсаном в макрофагах,является каскад метаболизма АК, причём во влиянии глутоксима и моликсана на [Ca2+]iзадействованы все три пути окисления АК – циклооксигеназный, липоксигеназный иэпоксигеназный.4.6. Влияние ингибиторов актин-связывающих белков на Са2+ответы, вызываемые глутоксимом и моликсаном в макрофагахДля исследования участия Arp2/3-комплекса в действии глутоксима и моликсана на[Ca2+]i использовали ингибитор Arp2/3-комплекса соединение СК-0944666 (рис. 50а).Впервые обнаружено, что предварительная инкубация макрофагов со 100 мкМ СК0944666 в течение 1 ч до введения 100 мкг/мл моликсана (рис.
51б) или 100 мкг/мл глутоксима(рис. 52б) вызывает практически полное подавление обеих фаз Са2+-ответов, индуцированныхэтими агентами. В среднем (по данным 7 экспериментов для каждого из препаратов)подавление мобилизации Са2+ из депо составило 88,9 ± 5,2% и 86,7 ± 5,0%, а входа Са2+ - 91,1 ±6,7% и 89,3 ± 6,2% для моликсана и глутоксима соответственно.Рис. 50. Ингибиторы актин-связывающих белкова – Ингибитор Arp2/3-комплекса соединение СК 0944666; б – ингибитор белков WASPвискостатин.Таким образом, впервые выявлено участие Arp2/3 комплекса, одного из ключевыхрегуляторов полимеризации актина, в действии глутоксима и моликсана на [Ca2+]i вмакрофагах.
Это свидетельствует о том, что Arp2/3 комплекс и актиновый цитоскелет являютсяактивными участниками процессов Са2+-сигнализации в макрофагах. Результаты согласуются сданными, полученными на других иммунных клетках. Так, обнаружено, что в Т-лимфоцитах129при активации Т-клеточного рецептора запускается сигнальный каскад, приводящий кувеличению [Ca2+]i. В этом каскаде задействованы Arp2/3 комплекс и актиновый цитоскелет(Kumari et al., 2014; Joseph et al., 2014). Результаты о подавлении соединением СК-0944666депо-зависимого входа Са2+, индуцированного глутоксимом или моликсаном, согласуются сданными, полученными на Т-клетках.
Так, в Т-лимфоцитах с дефектным белком WAVE2,активирующим Arp2/3 комплекс, наблюдается подавление депо-зависимого входа Са2+,активируемого тапсигаргином (Nolz et al., 2006).Наряду с Arp2/3-комплексом, важную роль в регуляции реорганизаций актиновогоцитоскелета играют белки семейства WASP (Bouma et al., 2009). Для исследования возможнойроли WASP белков в действии глутоксима и моликсана на [Са2+]i в макрофагах былиспользован ингибитор WASP белков вискостатин (рис. 50б). Установлено, что этонизкомолекулярное соединение взаимодействует с доменом GBD, что, вероятно, приводит кстабилизации WASP-белков в неактивном состоянии (Peterson et al., 2004).Показано, что предварительная инкубация макрофагов с 30 мкМ вискостатина в течение15 мин до введения 100 мкг/мл глутоксима приводит к существенному подавлению как фазымобилизации Са2+ из депо (в среднем на 57,6 %), так и фазы входа Са2+ (в среднем на 71,2 %)(рис.
53б). Показано также, что добавление 40 мкМ вискостатина во время уже развившегосявхода Са2+, индуцированного глутоксимом, приводит к существенному (в среднем на 42,3 %)подавлению входа Са2+ (рис. 53а). Аналогичные данные получены с применением 100 мкг/млмоликсана (результаты не представлены).Полученные результаты свидетельствуют о том, что WASP белки также участвуют врегуляции обеих фаз Са2+-ответа, индуцированного глутоксимом или моликсаном, вмакрофагах.
Новые данные согласуются с данными о влиянии вискостатина на процессыионного транспорта и ионные каналы, полученными в других лабораториях. Так, преинкубацияклеток эпителия толстой кишки и клеток печени млекопитающих с вискостатином существенноуменьшает Cl¯-токи, опосредованные CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator– регулятор трансмембранной проводимости при цистофиброзе) (Ganeshan et al., 2007).
Авторыпредполагают, что ингибирование CFTR связано с нарушением структуры актиновогоцитоскелета, вызываемым вискостатином, и, следовательно, с нарушением везикулярноготранспортаирециркуляцииканалов(Ganeshanetal.,2007).130Рис. 51. Влияние соединения СК-0944666 на эффект моликсана на [Ca2+]iв макрофагахПо вертикали и горизонтали – то же, что на рис. 33.а - клетки инкубировали в течение 20 мин в присутствии 100 мкг/мл моликсана вноминально бескальциевой среде, после чего вход Са2+ инициировали введением в наружнуюсреду 2 мМ Са2+.б – клетки предварительно инкубировали в течение 1 ч с 100 мкМ СК-0944666 вбескальциевой среде, затем добавляли 100 мкг/мл моликсана, через 20 мин вход Са2+инициировали введением в наружную среду 2 мМ Са2+.131Рис.
52. Влияние соединения СК-0944666 на эффект глутоксима на [Ca2+]iв макрофагахПо вертикали и горизонтали – то же, что на рис. 33.а - клетки инкубировали в течение 20 мин в присутствии 100 мкг/мл глутоксима вноминально бескальциевой среде, после чего вход Са2+ инициировали введением в наружнуюсреду 2 мМ Са2+.б – клетки предварительно инкубировали в течение 1 ч с 100 мкМ СК-0944666 вбескальциевой среде, затем добавляли 100 мкг/мл глутоксима, через 20 мин вход Са2+инициировали введением в наружную среду 2 мМ Са2+.132Рис.
53. Влияние вискостатина на эффект глутоксима на [Ca2+]i в макрофагахПо вертикали и горизонтали – то же, что на рис. 32.а – клетки инкубирования со 100 мкг/мл глутоксима в течение 20 мин в номинальнобескальциевой среде, затем вход Са2+ инициировали введением 2 мМ Са2+ в наружную среду, нафоне развившегося входа Са2+ вводили 40 мкМ вискостатина.б – клетки предварительно инкубировали в номинально бескальциевой среде с 30 мкМвискостатина в течение 15 мин до введения 100 мкг/мл глутоксима, через 20 мин после введенияглутоксима вход Са2+ инициировали введением 2 мМ Са2+ в наружную среду.133Новые результаты об участии актин-связывающих белков WASP и Arp2/3-комплекса вдействии глутоксима и моликсана указывают на то, что интактность актинового цитоскелета иего способность к динамической реорганизации являются необходимыми условиями для развития комплексного сигнального каскада, запускаемого глутоксимом или моликсаном и приводящего к двухфазному увеличению [Ca2+]i в макрофагах.Полученные данные согласуются с результатами более ранних исследований участияактинового цитоскелета в действии глутоксима и моликсана на [Ca2+]i.
Так, на кафедребиофизики было впервые выявлено, что как стабилизаторы (джасплакинолид, каликулин А),так и деполимеризаторы (латрункулин В, цитохалазин D) актиновых филаментов вызываютподавление как мобилизации Са2+, так и последующего входа Са2+, вызванных глутоксимомили моликсаном в перитонеальных макрофагах крысы (Kurilova et al., 2013; Миленина и др.,2014; Krutetskaya et al., 2014).
Более того, морфологические исследования с окраской актинародамин-фаллоидином показали, что глутоксим и моликсан сами вызывают реорганизациюактинового цитоскелета в макрофагах (Курилова и др., 2012б). Так, в нативных макрофагахэлементы актинового цитоскелета локализованы под плазматической мембраной и образуютчетко различимый кортикальный слой, а в клетках, обработанных глутоксимом илимоликсаном, кортикальный слой становится более широким и «рыхлым» и появляютсяскопления актина в цитозоле (Курилова и др., 2012).На основании результатов, представленных в настоящей работе, и более ранних данныхможно предположить, что при действии глутоксима и моликсана происходит активация белковWASP и, как следствие, белков Arp2/3-комплекса, которые запускают реорганизацию иветвление актиновых филаментов в макрофагах. Перестройки кортикального актина, повидимому, являются необходимым условием для передачи сигналов внутрь клетки, в том числе,для проведения сигнала от плазмалеммы к внутриклеточным Са2+-депо и развития мобилизацииСа2+ из депо (Курилова и др., 2006; Kurilova et al., 2013; Krutetskaya et al., 2014).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
