Диссертация (1145903), страница 25
Текст из файла (страница 25)
54).138Известно, что в плазматической мембране макрофагов экспрессируется целый рядрецепторов с собственной тирозинкиназной активностью, в том числе представители семействRON/STK (recepteur d’origine nantais/ stem cell-derived tyrosine kinase), Axl/Tyro3/Mer, c-fms(Correl et al., 2004). Глутоксим и моликсан могут трансактивировать в плазмалемме макрофаговрецепторную тирозинкиназу, что приводит к запуску каскада метаболизма АК с участиемФЛА2, ЦОГ, 5- и 12-ЛОГ.В норме продукты ЦОГ и ЛОГ обеспечивают динамичную реорганизацию актиновогоцитоскелета, которая необходима для запуска обеих фаз Са2+-ответов, вызываемыхглутоксимом и моликсаном.
Участие этих биологически активных соединений в действииглутоксима и моликсана может быть обусловлено их действием на такие элементы актиновогоцитоскелета, как белки WASP и комплекс Arp 2/3, запускающие полимеризацию и ветвлениеактиновых филаментов.Вероятно, для динамичности и лабильности актиновых филаментов необходим балансмежду обеими группами метаболитов АК. Ингибирование ЦОГ нарушает способностьактинового цитоскелета к разборке и фактически воспроизводит эффект каликулина А илиджасплакинолида, а ингибирование 5- или 12-ЛОГ приводит к дестабилизации F-актинаподобно цитохалазину D или латрункулину В. В результате воздействие каждого изисследованных ингибиторов каскада метаболизма АК приводит к значительному или полномуподавлению как мобилизации Са2+ из депо в ответ на глутоксим и моликсан, так ипоследующего входа Са2+ из наружной среды по депо-зависимому механизму.139Рис.
54. Предполагаемый механизм участия фосфолипаз А2, циклооксигеназ илипоксигеназ в действии глутоксима и моликсана на актиновый цитоскелет и [Са2+]i вперитонеальных макрофагах крысыОбъяснения в тексте.4-БФБ – 4-бромфенацилбромид; НДГК – нордигидрогуаретиковая кислота; Arp2/3комплекс - actin-related protein 2/3 (белок, связанный с актином 2/3); WASP - Wiskott–AldrichSyndrome protein (белок синдрома Вискотта – Олдрича).140Результаты, полученные в настоящей работе, свидетельствуют также о том, что ферменты и/или продукты эпоксигеназного пути окисления АК играют важную роль в действии глутоксима и моликсана на [Са2+]i в макрофагах.
Однако механизмы участия эпоксигеназного путидалеки от полного понимания.Эпоксигеназы и их продукты традиционно рассматриваются исследователями каккандидаты на роль растворимых факторов входа Са2+, передающих информацию обопустошении депо к депо-зависимым Са2+-каналам плазмалеммы. В то же время основныммеханизмом входа Са2+ в перитонеальные макрофаги крысы является «связывание по типусекреции» (secretion-like coupling model), ключевыми участниками которого являютсяактиновые филаменты (Курилова и др., 2006, 2007).
Однако было показано, что в различныхтипах клеток возможно сочетание нескольких механизмов депо-зависимого входа Са2+. Так, вклетках эндотелия роговицы быка выявлено сосуществование двух механизмов входа Са2+: сучастием растворимого посредника и механизма входа Са2+ «связывание по типу секреции»(secretion-like coupling model) (Xie et al., 2002). Так, стабилизатор актиновых филаментовкаликулин А не вызывал подавления входа Са2+, активируемого β-нафтофлавоном или 5,6ЭЭТК в клетках этого типа (Xie et al., 2002). Вероятно, это связано с тем, что метаболитыцитохромаР-450,выступающиевролифактороввходаСа2+,являютсямалымиводорастворимыми молекулами, которые легко могут диффундировать к плазмалемме сквозьплотный слой кортикального актина, формирующийся при действии каликулина А (Xie et al.,2002).
Следовательно, цитохромы Р450 и их продукты способны обращать ингибирующийэффект стабилизаторов актиновых филаментов (Xie et al., 2002).Кроме того, было установлено, что продукты цитохромов Р450 (в частности, 20-ГЭТЕК)могут вызывать активацию G-белков суперсемейства Ras в гладкомышечных клеткахкровеносных сосудов (Muthalif et al., 1998), а также активировать фосфатидилинозитол-3киназу в клетках эндотелия аорты и эпителия почки (Chen et al., 2001; Wang et al., 2005).
БелкиRas и ФИК, в свою очередь, необходимы для реорганизации актиновых филаментов и дляактивации депо-зависимого входа Са2+ в соответствии с моделью «связывание по типусекреции».1415. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕВ настоящей работе впервые показано, что ферменты и продукты каскада метаболизмаАК играют важную роль в запуске и регуляции Са2+-ответов, вызываемых глутоксимом имоликсаном в перитонеальных макрофагах крысы. Так, с использованием структурноразличных ингибиторов ФЛА2 установлено, что эти ферменты необходимы для формированияобеих фаз увеличения [Са2+]i, вызываемого глутоксимом и моликсаном.
В экспериментах сприменением широкого спектра ингибиторов ЦОГ, ЛОГ и цитохромов Р450 впервые показаноучастие циклооксигеназного, липоксигеназного и эпоксигеназного путей метаболизма АК вдействии глутоксима и моликсана на [Са2+]i в перитонеальных макрофагах крысы. Кроме того,полученные результаты указывают на нежелательность совместного клинического применениялекарственных средств на основе ингибиторов каскада метаболизма АК с препаратамиглутоксим и моликсан.Также впервые выявлено, что в действии глутоксима и моликсана на [Са2+]i вмакрофагах важную роль играют актин-связывающие белки, запускающие рост и ветвлениеактиновых филаментов.
Так, с использованием специфического ингибитора белков WASPвискостатина и специфического ингибитора Arp 2/3-комплекса соединения СК-0944666показано участие этих белков в регуляции Са2+-ответов, вызываемых глутоксимом имоликсаном в макрофагах. Эти результаты подтверждают более ранние данные о том, что длягенерации увеличения [Са2+]i в ответ на глутоксим и моликсан необходимы перестройкиактинового цитоскелета (Крутецкая и др., 2011; Курилова и др., 2012; Kurilova et al., 2013).На основании результатов, полученных в настоящей работе и ранее, а также данныхлитературы можно предположить следующую модель участия каскада метаболизма АК иэлементов актинового цитоскелета в действии иммуномодуляторов на основе GSSG на [Са2+]i вперитонеальных макрофагах крысы (рис.
55).Вероятно, воздействие глутоксима или моликсана приводит к трансактивациирецепторов, связанных с гетеротримерными G-белками, и рецепторных тирозинкиназ вплазматической мембране макрофагов. При этом происходит запуск фосфоинозитидного путипередачи сигналов и мобилизация Са2+ из внутриклеточных Са2+-депо. Сигнал об опустошениидепо передаётся Са2+-каналам в плазмалемме по депо-зависимому механизму.
Кроме того, придействии глутоксима и моликсана в макрофагах, вероятно, происходит запуск каскадаметаболизма АК: активация фосфолипаз А2 и продукция большого количества АК, а такжеактивация ЦОГ, ЛОГ и цитохромов Р450, которые окисляют АК с образованием широкогоспектра эйкозаноидов.142Эйкозаноиды, в свою очередь, выступают в роли посредников в действии глутоксима имоликсана на [Са2+]i.
Так, эти соединения могут непосредственно модулировать активностьионных каналов, участвующих в процессах Са2+-сигнализации, запускаемых глутоксимом илимоликсаном. Кроме того, участие циклооксигеназного и липоксигеназного путей может бытьопосредовано влиянием на элементы актинового цитоскелета, в том числе на актинсвязывающие белки WASP и комплексы белков Arp2/3. Интактные, способные к реорганизацииактиновые филаменты необходимы для генерации Са2+-ответов, индуцируемых глутоксимом имоликсаном в перитонеальных макрофагах крысы. Реорганизация кортикального слоя актина,по-видимому,необходимадляпередачисигналаотрецепторовплазмалеммыквнутриклеточным Са2+-депо и развития мобилизации Са2+ из депо. Кроме того, актиновыефиламенты необходимы для активации депо-зависимого входа Са2+ согласно модели«связывание по типу секреции».Ферменты и продукты эпоксигеназного пути метаболизма АК также играют важнуюроль в действии глутоксима и моликсана на [Са2+]i в макрофагах.
Однако механизмы участияэпоксигеназного пути окисления АК мало изучены. Существуют данные о том, чтоэпоксигеназы или их продукты активируют депо-зависимые Са2+-каналы, выступая в качествефакторов входа Са2+, или участвуют в активации ФИК и малых G-белков суперсемейства Ras,которые также играют важную роль в перестройках актиновых филаментов.Таким образом, в настоящей работе выявлены новые участники сигнального каскада,запускаемогоглутоксимомимоликсаномиприводящегокувеличению[Са2+]iвперитонеальных макрофагах крысы: каскад метаболизма АК и актин-связывающие белкиWASP и комплекс белков Arp2/3.
Однако тонкие биофизические механизмы участия этихсистем в действии глутоксима и моликсана на макрофаги остаются предметом для дальнейшихисследований.Рис. 55 (см. на с. 146)143144Рис. 55. Возможные механизмы действия глутоксима и моликсана навнутриклеточную концентрацию Са2+ в макрофагах: участие каскада метаболизмаарахидоновой кислоты и актинового цитоскелетаГлутоксим и моликсан вызывают трансактивацию рецепторной тирозинкиназы илипуринергического рецептора P2Y2-типа, связанного с гетеротримерным G-белком (G), чтоприводит к запуску фосфоинозитидного пути передачи сигнала с участием фосфолипазы Сγ(ФЛCγ) или β (ФЛCβ).
ФЛC расщепляют фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат (PIP2) на двавторичных посредника: инозитол-1,4,5-трифосфат (IP3) и диацилглицерол (ДАГ). IP3активирует IP3-рецепторы, в результате чего происходит выход Са2+ из внутриклеточных Са2+депо. Сигнал об опустошении Са2+ депо передаётся депо-зависимым Са2+-каналам вплазмалемме, и происходит депо-зависимый вход Са2+.ДАГ активирует протеинкиназу С (ПКС), которая, в свою очередь, стимулируетфосфолипазы А2 (ФЛA2) и циклооксигеназы (ЦОГ). Кроме того, глутоксим и моликсан могутзапускать тиол-дисульфидный обмен между остаками цистеина (Cys) в трансмембранныхбелках, что приводит к снижению соотношения концентраций восстановленного и окисленногоглутатиона (GSH/GSSG) и слабому окислительному стрессу.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
