Диссертация (1145903), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Ранееустановлено, что последующий вход Са2+ из наружной среды, вызванный глутоксимом илимоликсаном в макрофагах, происходит по депо-зависимому механизму (Курилова и др., 2008).Основной моделью депо-зависимого входа Са2+ в перитонеальные макрофаги крысы, повидимому,является«связываниепотипусекреции»,чтопредполагаетобратимуютранслокацию Са2+-депо к плазмалемме за счёт динамично перестраивающихся актиновыхфиламентов (Kurilova et al., 2013; Krutetskaya et al., 2014). В свою очередь, ингибированиебелков WASP и Arp2/3 комплекса при действии вискостатина и соединения СК-0944666 делаетневозможным перестройки микрофиламентов и предотвращает депо-зависимый вход Са2+,индуцируемый глутоксимом и моликсаном в макрофагах.1344.7.
Возможная роль каскада метаболизма арахидоновойкислоты и актинового цитоскелета в действии глутоксима имоликсана на внутриклеточную концентрацию Са2+ в макрофагахРанее на кафедре биофизики СПбГУ было впервые показано, что в действии глутоксимана [Ca2+]i в макрофагах принимают участие такие сигнальные молекулы, как тирозинкиназы итирозинфосфатазы (Крутецкая и др., 2007; Курилова и др., 2008), ФИ3К и ФИ4К (Крутецкая идр., 2008), ключевые ферменты фосфоинозитидного пути передачи сигнала ФЛС и ПКС(Крутецкая и др., 2009), актиновые филаменты (Крутецкая и др., 2011; Курилова и др., 2012б;Kurilova et al., 2013), микротрубочки (Крутецкая и др., 2013), рецепторы, ассоциированные сгетеротримерными G-белками (Krutetskaya et al., 2014), малые G-белки суперсемейства Ras(Крутецкая и др., 2014).
Кроме того, было впервые установлено, что в действии препаратамоликсан на [Ca2+]i в макрофагах принимают участие тирозинкиназы и тирозинфосфатазы(Курилова и др., 2011б), микротрубочки (Курилова и др., 2012а), актиновые филаменты(Курилова и др., 2012б; Kurilova et al., 2013; Миленина и др., 2014), малые G-белкисуперсемейства Ras (Крутецкая и др., 2014).В настоящей работе выявлены новые участники сигнального каскада, запускаемогоглутоксимом и моликсаном в макрофагах: важнейшие пути метаболизма АК, а также актинсвязывающие белки WASP и Arp2/3-комплекс.Запуск каскада метаболизма арахидоновой кислоты под действием глутоксима имоликсана.
Полученные результаты позволяют предположить, что глутоксим и моликсаноказывают комплексное воздействие на макрофаги, которое приводит к увеличению [Са2+]i исопровождается активацией каскада метаболизма АК с участием ФЛА2, ЦОГ, ЛОГ ицитохромов Р450. Продукты окисления АК, в свою очередь, регулируют обе фазы Са2+-ответов,индуцированных глутоксимом и моликсаном.В макрофагах АК высвобождается из мембранных фосфолипидов преимущественно сучастием ФЛА2. Установлено, что ФЛА2 могут активироваться при действии на клеткиокисляющих агентов (Goldman et al., 1992; van Rossum et al., 2004; Jezek et al., 2010).
В то жевремя известно, что воздействие GSSG приводит к увеличению соотношения GSSG/GSH,продукции некоторого количества окислителей (например, Н2О2) и, как следствие, генерациислабого окислительного стресса в клетке (Filomeni et al., 2002; Townsend et al., 2008). Вероятно,глутоксим и моликсан оказывают сходное влияние на редокс-статус клеток, вызывая в цитозолеслабый окислительный стресс. Следствием является окисление ключевых остатков цистеина135ФЛА2, которое приводит к непосредственной активации фермента и образованию свободнойАК.Изменение редокс-баланса цитозоля и окислительные модификации – это факторы,которые также могут регулировать активность ферментов, окисляющих АК в различных типахклеток. В частности, активирующее действие S-глутатионилирования установлено для ЛОГ(Hatzelmann, Ullrich, 1987; Park et al., 2009).
Следовательно, можно предположить, чтоглутоксим и моликсан активируют ферменты каскада метаболизма АК за счёт увеличениявнутриклеточной концентрации GSSG и генерации в цитозоле слабого окислительного стресса.Однако возможна также рецептор-опосредованная активация каскада метаболизма АКпод действием глутоксима и моликсана. Целый ряд экспериментальных доказательствсвидетельствует в пользу рецептор-опосредованной активации ФЛА2 в клетках различныхтипов.
Так, установлено, что стимуляция рецептора EGF в клетках А431 карциномы человека,клетках HeLa или клетках аденокарциномы человека приводит к активации ФЛА2 споследующей продукцией АК (Peppelenbosch et al., 1992, 1993; Croxtall et al., 2000). Такимобразом, можно предположить, что трансактивация глутоксимом или моликсаном рецептора ссобственной тирозинкиназной активностью также приводит к активации ФЛА2 в макрофагах.Трансактивация мембранных рецепторов под действием глутоксима и моликсана можеттакже сопровождаться активацией ФЛС и запуском фосфоинозитидного пути передачи сигналас продукцией вторичного мессенджера ДАГ, который активирует ПКС. Установлено, чтоактивация ПКС запускает освобождение АК из мембранных фосфолипидов с участием ФЛА2 вразличных популяциях макрофагов (Крутецкая и др., 2003).Показано, что при стимуляции ПКС в макрофагах происходит активация каскадаметаболизма АК, причём преимущественно по циклооксигеназному пути (Крутецкая и др.,2003).
Например, инкубация резидентных перитонеальных макрофагов крысы в течение 30минут с активатором ПКС форболовым эфиром РМА (4β-phorbol 12-myristate 13-acetate; 4βфорбол-12-миристат-13-ацетат) приводит к существенному возрастанию продукции свободнойАК и активации циклооксигеназного пути окисления АК с образованием ПГ-E2, -D2, 6кетопростагландина F2α и ТК-В2 (Peters-Golden et al., 1990).Таким образом, комплексное действие глутоксима и моликсана на макрофаги можетприводить к запуску каскада метаболизма АК и образованию широкого спектра различныхэйкозаноидов (простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов, гидрокси- и эпоксикислот).Продукты метаболизма АК, в свою очередь, оказывают модулирующее воздействие насигнальные процессы с участием ионов Са2+. Можно предложить несколько механизмов,которые опосредуют участие продуктов каскада метаболизма АК в действии глутоксима имоликсана на [Са2+]i в макрофагах.136Непосредственная модуляция Са2+-ответов продуктами метаболизма АК.
АК ицелый ряд эйкозаноидов – это вторичные посредники, которые способны модулироватьактивность различных типов ионных каналов (Крутецкая, Лебедев, 1995; Meves, 2008).Например, каналы TRPV1 могут непосредственно активироваться продуктами ЛОГ (5-, 12-, 15ГПЭТЕК, ЛТ-В4), а каналы TRPV4 – продуктами цитохромов Р450, в том числе 5,6-ЭЭТЕК(Vriens et al., 2005; Meves, 2008). Таким образом, можно предположить, что продуктыциклооксигеназного, липоксигеназного или эпоксигеназного путей окисления АК могутнепосредственно активировать IP3-чувствительные каналы выброса Са2+ в мембраневнутриклеточных Са2+-депо, вызывая мобилизацию Са2+. Опустошение Са2+-депо, в своюочередь, приводит к активации депо-зависимого входа Са2+ в клетки.
Эта гипотеза согласуется сданными об активации мобилизации Са2+ из депо под действием ЛТ-В4 и -С4 (Itagaki et al.,2011).Последующий запуск депо-зависимого входа Са2+ может быть обусловлен какопустошением депо, так и активирующим действием ферментов и/или продуктов метаболизмаАК на депо-зависимые Са2+-каналы в плазмалемме и вход Са2+ в клетки. Так, некоторыеметаболиты эпоксигеназного пути окисления АК (например, 5,6-ЭЭТЕК) могут выступать вроли растворимых вторичных посредников, передающих информацию об опустошении Са2+депо к Са2+-каналам плазмалеммы (Alvarez et al., 1992; Rzigalinski et al., 1999; Xie et al., 2002).Кроме того, показано, что в активации депо-зависимого входа Са2+ может участвовать Са2+нечувствительная ФЛА2 (iPLA2) (Smani et al., 2004; Bolotina, Csutora, 2005).
Так, предложенамодель, согласно которой этот фермент активируется в результате опустошения Са2+-депо ипродуцирует лизофосфолипиды, непосредственно активирующие Са2+-каналы плазмалеммы ивход Са2+ по депо-зависимому механизму (Smani et al., 2004; Bolotina, Csutora, 2005).Результаты, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о совместном участиивсех трёх путей метаболизма АК в действии глутоксима и моликсана на [Са2+]i в макрофагах.Влияние компонентов каскада метаболизма арахидоновой кислоты на перестройкиактинового цитоскелета.
Целый ряд экспериментальных данных свидетельствует о том, чтопродукты метаболизма АК модулируют перестройки актинового цитоскелета. Так, на клеткахА431 карциномы человека, клетках HeLa и фибробластах крысы линии rat-1 было установлено,что взаимодействие EGF с соответствующей рецепторной тирозинкиназой приводит кполимеризации кортикального актина, разрушению стресс-фибрилл и изменению формы клеток(Peppelenbosch et al., 1993). При этом запускаемая EGF полимеризация актина опосредованапродуктами 5-ЛОГ. Оказалось также, что продукты 5-ЛОГ (ЛТ-С4, ЛТ-D4 и ЛТ-Е4) самиспособны индуцировать быструю полимеризацию кортикального актина (Peppelenbosch et al.,1993).
Воздействие продуктов ЦОГ (ПГ-Е2, ПГ-I2 и ПГ-F2), напротив, приводило к137деполимеризации актиновых филаментов (F-актина) и разрушению стресс-фибрилл в трёхисследованных типах клеток (Peppelenbosch et al., 1993). При этом ингибированиевысвобождения АК под действием ФЛА2 с помощью 4-БФБ предотвращало перестройкиактинового цитоскелета, вызываемые EGF в этих клетках. На основании полученныхрезультатов авторами была предложена модель участия продуктов метаболизма АК вперестройках актинового цитоскелета при действии EGF (Peppelenbosch et al., 1993).Согласно данной модели, взаимодействие EGF с соответствующей рецепторнойтирозинкиназой приводит к активации цитоплазматической ФЛА2, которая высвобождает АКиз мембранных фосфолипидов (Peppelenbosch et al., 1993).
АК, в свою очередь, окисляется сучастием ЦОГ с образованием ПГ и с участием 5-ЛОГ – до ЛТ. Продукты ЛОГ обеспечиваютполимеризацию кортикального актина и образование актиновых стресс-фибрилл, а продуктыЦОГ – наоборот, разборку актиновых филаментов (Peppelenbosch et al., 1993). Впоследствиибыло выявлено, что активация полимеризации актина под действием ЛТ опосредована ихвлиянием на малые G-белки Rho – представители суперсемейства Ras (Peppelenbosch et al.,1995).Установлено, что активность 12/15-ЛОГ также необходима для полимеризации актина вперитонеальных макрофагах мыши (Miller et al., 2001).Таким образом, продукты ЦОГ и ЛОГ совместно обеспечивают динамичнуюреорганизацию актиновых филаментов и морфологические изменения клеток в ответ надействие EGF (Peppelenbosch et al., 1993).Ранее на кафедре биофизики СПбГУ было впервые установлено, что воздействиестабилизаторов кортикального актина (каликулин А, джасплакинолид) и длительноевоздействие деполимеризаторов актиновых филаментов (цитохалазин D, латрункулин В)приводит к ингибированию обеих фаз Са2+-ответов, индуцированных глутоксимом имоликсаном в перитонеальных макрофагах крысы (Kurilova et al., 2013; Krutetskaya et al., 2014).В настоящей работе показано, что ингибитор комплекса Arp 2/3 соединение СК-0944666 иингибитор белков WASP вискостатин также вызывают подавление увеличения [Са2+]i,индуцируемогоглутоксимомимоликсаном.Всовокупностивсеэтирезультатысвидетельствуют о том, что интактность актиновых филаментов и их способность кдинамичной реорганизации необходимы для запуска сигнального каскада в ответ на глутоксими моликсан.Исходя из результатов настоящей работы и более ранних исследований по даннойтематике, а также данных литературы, можно предложить модель перестроек актиновыхфиламентов под влиянием глутоксима и моликсана, сходную с моделью действия на актиновыйцитоскелет эпидермального фактора роста (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
