Диссертация (1145903), страница 19
Текст из файла (страница 19)
33а, 34а, 36, 37а, 39а, 42а, 44, 46а, 52а, 53а) или 100 мкг/мл моликсана (рис.32а, 35а, 38а, 40а, 41а, 43а, 47а, 48а, 51а) в бескальциевой среде вызывает медленнонарастающее увеличение [Ca2+]i, отражающее мобилизацию Са2+ из внутриклеточных депо. Всреднем (по данным 6 экспериментов для каждого из препаратов) через 20 - 23 мин последобавления агентов [Ca2+]i увеличивается от базального уровня, равного 161 ± 20 нМ дляглутоксима и 91 ± 16, до 153 ± 19 нМ - для моликсана. При введении в среду инкубации 2 мМСа2+ наблюдается дальнейшее повышение [Ca2+]i, отражающее вход Са2+ в цитозоль. В среднем(по данным 6 экспериментов для каждого из препаратов) увеличение [Ca2+]i во время входа Са2+составило 259 ± 18 нМ и 255 ± 21 нМ для глутоксима и моликсана соответственно.
Такимобразом, оба препарата оказывают сходное влияние на [Ca2+]i в перитонеальных макрофагахкрысы.4.2. Влияние ингибиторов фосфолипаз А2 на Са2+-ответы,вызываемые глутоксимом и моликсаномЗапуск каскада метаболизма АК с участием ФЛА2 является одним из ключевых событий вактивации макрофагов. Установлено, что в этих иммунокомпетентных клетках экспрессируютсясекреторные ФЛА2 (GV) и цитоплазматические ФЛА2, относящиеся к группам GIVA и GIVB(Са2+-зависимые), а также GVI (Са2+-независимые, iPLA2) (Chakraborti, 2003; Dennis et al., 2011).В связи с этим представлялось целесообразным исследовать участие ключевого («стартового»)фермента каскада – ФЛА2 – в действии препаратов глутоксим и моликсан на [Са2+]i вперитонеальных макрофагах крысы. Для достижения этой цели использовались три структурноразличных ингибитора ФЛА2: 4-бромфенацилбромид (4-БФБ) (рис.
31) и глюкокортикоидыдексаметазон и преднизолон (табл. 1).Впервые было обнаружено, что преинкубация клеток с 20 мкМ 4-БФБ в течение 15 мин довведения 100 мкг/мл моликсана приводит к подавлению как мобилизации Са2+ из депо (в среднем99по данным 7 экспериментов на 71,7 ± 4,7%), так и последующего входа Са2+ в клетку (в среднемпо данным 7 экспериментов на 72,6 ± 5,1%), вызываемых моликсаном (рис. 32б).
Сходныеданные были получены в опытах по влиянию 4-БФБ на Са2+-ответы, индуцируемые 100 мкг/млглутоксима (данные не представлены).Результаты частично согласуются с более ранними данными, полученными на кафедребиофизики СПбГУ, о влиянии 4-БФБ на процессы внутриклеточной Са2+-сигнализации(Крутецкая и др., 2000). Так, было установлено, что предварительная инкубация клеток с 4-БФБдо введения пуринергического агониста АТФ приводит к существенному подавлению депозависимого входа Са2+ в перитонеальные макрофаги крысы (Крутецкая и др., 2000; Крутецкая идр., 2003).
Введение 4-БФБ на фоне развившегося депо-зависимого входа Са2+, активируемогоАТФ, УТФ, тапсигаргином и циклопьязониковой кислотой, вызывало практически полноеподавление входа Са2+ в макрофаги (Крутецкая и др., 2000; Крутецкая и др., 2003).4-БФБ также ингибирует депо-зависимый вход Са2+, активируемый пуринергическимиагонистами АТФ и УТФ в клетках асцитной карциномы Эрлиха и макрофагах линии RAW 264.7(Gukovskaya, Zinchenko, 1990; Lin et al., 1998). В то же время предварительная инкубациятимоцитов крысы с данным агентом приводит к полному предотвращению увеличения [Ca2+]i,вызываемого конканавалином А (Gukovskaya, Zinchenko, 1990).Рис.
31. Структураблокаторафосфолипазбромфенацилбромидадибромоацетофенона)классическогоА24(2,4’-100Рис. 32. Влияние ингибиторов фосфолипазы А2 на увеличение [Ca2+]i, вызываемоемоликсаном в перитонеальных макрофагах крысыЗдесь и далее на рис. 36, 42 – 48, 52 по оси ординат – отношение интенсивностейфлуоресценции Fura-2AM F340/F380 при длинах волн возбуждающего излучения 340 и 380 нмсоответственно (относительные единицы, отн. ед.), по оси абсцисс – время (мин).а – клетки инкубировали в течение 20 мин в присутствии 100 мкг/мл моликсана вноминально бескальциевой среде, затем вход Са2+ индуцировали введением в наружную среду2 мМ Са2+;б, в, г – клетки предварительно инкубировали в течение 15 мин с 20 мкМ 4бромфенацилбромида (б), в течение 10 мин с 8 мкг/мл дексаметазона (в), в течение 16 мин с 25мкг/мл преднизолона (г) в бескальциевой среде, затем добавляли 100 мкг/мл моликсана, через20 мин вход Са2+ инициировали введением в наружную среду 2 мМ Са2+.Здесь и далее на рис.
33 - 52 каждая регистрация получена для группы из 40 – 50 клетоки представляет собой типичный вариант для 6 - 7 экспериментов.101Кроме того, в настоящей работе впервые показано, что преинкубация клеток с 8 мкг/млдексаметазона в течение 10 мин до введения 100 мкг/мл моликсана вызывает практически полноеподавление вызываемых моликсаном мобилизации Са2+ из депо (в среднем по данным 7экспериментов на 85,4 ± 5,9 %) и последующего входа Са2+ в цитозоль (в среднем по данным 7экспериментов на 89,6 ± 6,2%, рис.
32в). Преинкубация макрофагов с 25 мкг/мл преднизолона втечение 16 мин до введения 100 мкг/мл моликсана также приводит к подавлению мобилизацииСа2+ из депо (в среднем по данным 7 экспериментов на 73,8 ± 4,8%) и входа Са2+ (в среднем поданным 7 экспериментов на 71,4 ± 5,3%), индуцированных моликсаном (рис. 32г). Сходныеданные получены при использовании 100 мкг/мл глутоксима (данные не представлены).Из данных литературы известно, что глюкокортикоиды могут оказывать различноевоздействие на процессы внутриклеточной Са2+-сигнализации, которое зависит от типа ипопуляции клеток, времени инкубации и др. Так, инкубация клеток лимфомы мыши линииW7MG1 с дексаметазоном приводила к уменьшению мобилизации Са2+ из различныхвнутриклеточных депо, вызванной ионофором иономицином и ингибитором SERCAтапсигаргином (Lam et al., 1993). Сам дексаметазон вызывает сначала некоторое уменьшение, апотом постепенное повышение [Са2+]i, связанное с мобилизацией Са2+ из депо.
Этот эффект былрецептор-опосредованным и развивался с временной задержкой, по-видимому, необходимойдля воздействия комплексов глюкокортикоидных рецепторов на процессы транскрипции (Lamet al., 1993).Гарднер и Занг выявили стимулирующее влияние глюкокортикоидов на процессы Са2+сигнализации в культивируемых В-лимфобластах (Gardner, Zhang, 1999). Устновлено, чтодлительная (48 часов) инкубация лимфобластов с кортизолом приводит к снижению базальногоуровня [Са2+]i и усиливает Са2+-спайки, индуцированные фактором активации тромбоцитов(platelet activating factor, PAF). Кроме того, показано, что кортизол увеличивает концентрациюСа2+ во внутриклеточных депо и вызывает усиление депо-зависимого входа Ca2+ в ответ натапсигаргин (Gardner, Zhang, 1999). Длительное развитие эффекта кортизола, вероятно, такжесвидетельствует о том, что он опосредован глюкокортикоидными рецепторами в цитозоле,которые участвуют в регуляции транскрипции (Gardner, Zhang, 1999).Описанные эффекты глюкокортикоидов на внутриклеточную Са2+-сигнализациюявляются длительными и связаны с их действием на цитоплазматические глюкокортикоидныерецепторы и процессы транскрипции.
В настоящей работе, напротив, исследовано острое (втечение 10 - 15 мин) действие этих препаратов на увеличение Са2+, вызванное глутоксимом имоликсаном в макрофагах.Известно несколько основных механизмов быстрого (rapid) влияния глюкокортикоидов(Buttgereit, Scheffold, 2002). В качестве одного из них рассматривается специфическое102взаимодействие этих соединений с цитоплазматическими глюкокортикоидными рецепторами(cytosolic glucocorticoid receptors; сGCR) (Buttgereit, Scheffold, 2002). Неактивный сGCRнаходится в цитозоле в составе мультибелкового комплекса, который включает белкитеплового шока (hsp90) и протеинкиназы. Хотя связывание глюкокортикоидов с сGCR изапускает геномные эффекты, оно также приводит к быстрой модуляции сигнальных событий сучастием различных элементов комплекса (Buttgereit, Scheffold, 2002).Так, показно, что взаимодействие EGF (epidermal growth factor, эпидермальный факторроста)ссоответствующейрецепторнойтирозинкиназойприводиткактивациицитоплазматической ФЛА2 и образованию АК в клетках аденокарциномы человека линии А549(Croxtall et al., 2000).
Воздействие дексаметазона быстро ингибирует запускаемую EGFпродукцию свободной АК. Этот эффект опосредован сGCR, но, по-видимому, не связан срегуляцией транскрипции (Croxtall et al., 2000). Авторы предполагают, что наблюдаемыйострыйэффектдексаметазонасвязансцитоплазматическойтирозинкиназойSrc,локализованной в мультибелковом комплексе совместно с сGCR. Действие глюкокортикоидовприводит к независимому высвобождению как сGCR, так и Src, которая фосфорилирует иактивирует белок липокортин 1, ингибирующий ФЛА2 (Croxtall et al., 2000).Кроме того, глюкокортикоиды, как производные холестерина, могут встраиваться влипидный бислой. Показано, что в высоких концентрациях эти препараты могут изменятьфизико-химические свойства биологических мембран, влияя, таким образом, на активностьтрансмембранных белков и транспорт ионов (Buttgereit, Scheffold, 2002).Таким образом, можно предположить, что влияние глюкокортикоидов на Са2+-ответы,запускаемые глутоксимом и моликсаном в макрофагах, обусловлено их быстрым действием нацитоплазматическую ФЛА2.
Полученные результаты совместно с данными о влиянии другогоингибитора ФЛА2 4-бромфенацилбромида свидетельствуют об участии ФЛА2 и каскадаметаболизма АК в действии глутоксима и моликсана на [Ca2+]i в перитонеальных макрофагахкрысы. Однако нельзя исключить также дополнительное влияние глюкокортикоидов на Са2+каналы или АТФазы, опосредованное изменением свойств цитоплазматической мембраны имембран внутриклеточных Са2+-депо.Глюкокортикоидыширокоиспользуютсякакпротивовоспалительные,антиаллергические, противошоковые гормональные лекарственные средства (табл. 1). В связи сэтимполученныерезультатыпозволяютпредположитьнежелательностьсовместногоприменения глюкокортикоидов с препаратами глутоксим и моликсан в клинической практике.1034.3.
Влияние ингибиторов циклооксигеназ на Са2+-ответы,индуцируемые глутоксимом и моликсаномПо сравнению с другими иммунными клетками, макрофаги являются наиболееактивными производителями всего спектра эйкозаноидов (Крутецкая и др., 2003). Ониспособны синтезировать и секретировать метаболиты АК в ответ на многие физиологическиестимулы. В перитонеальных макрофагах АК, освобождаемая из мембранных фосфолипидов поддействием ФЛА2, окисляется преимущественно по циклооксигеназному и липоксигеназномупутям (Крутецкая и др., 2003).Среди медиаторов воспаления, продуцируемых активированными фагоцитами, важнуюроль играют ПГ и ТК, которые образуются при окислении АК ферментами циклооксигеназами(ЦОГ) (Wilborn et al., 1995). В различных типах макрофагов экспрессируются обе изоформыЦОГ: конститутивная (ЦОГ-1) и индуцибельная (ЦОГ-2).
Показано, что основное количествоПГ в альвеолярных и перитонеальных макрофагах как в покое, так и при активации клетокбактериальным липополисахаридом продуцируется именно с участием ЦОГ-1. Индуцибельнаяже изоформа в обоих случаях вносит умеренный вклад в продукцию медиаторов воспаления(Wilborn et al., 1995).Для выявления возможного участия продуктов и/или ферментов циклооксигеназногопути метаболизма АК в действии глутоксима и моликсана на [Ca2+]i в перитонеальныхмакрофагах крысы были использованы два структурно различных неселективных ингибитораЦОГ: 1) индометацин (производное пиразолидинона); 2) ацетилсалициловая кислота(аспирин). Структура фармакологических агентов представлена в таблице 1.Показано, что предварительная инкубация макрофагов в течение 5 минут с 20 мкМиндометацина вызывает значительное уменьшение фазы мобилизации Са2+ из внутриклеточныхдепо и фазы входа Са2+, индуцированных 100 мкг/мл глутоксима (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
