Диссертация (1145903), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Выявлена структурнофункциональная организация ключевых ферментов, участвующих в каскаде метаболизма АК, атакже широкий спектр фармакологических агентов, ингибирующих эти ферменты. Многие изэтих соединений входят в состав лекарственных препаратов, используемых в терапиивоспалительных, аллергических, грибковых заболеваний.Достигнут значительный прогресс в изучении структурно-функциональной организацииактинового цитоскелета. Установлено, что в реорганизации актиновых филаментов участвуетцелый арсенал актин-связывающих белков. Особую роль в запуске роста и ветвлениямикрофиламентов играют белки WASP и Arp 2/3-комплекс.Многочисленные исследования посвящены редокс-регуляции активности клеточныхбелков и экспрессии генов. Установлено, что редокс-чувствительность характерна для белков,участвующих в Са2+-сигнализации, ферментов каскада метаболизма АК, и актиновыхфиламентов. Особая роль в редокс-регуляции принадлежит системе GSH/GSSG.
На основеGSSGсинтезированыпрепаратыглутоксимимоликсан–иммуномодуляторыицитопротекторы, влияющие на редокс-гомеостаз иммунных клеток.Ранее на кафедре биофизики СПбГУ было впервые показано, что глутоксим и моликсанзапускаюткомплексныйсигнальныйкаскад,приводящийкувеличению[Ca2+]iвперитонеальных макрофагах крысы, ключевыми компонентами которого являются такиесигнальные молекулы, как тирозинкиназы и тирозинфосфатазы (Крутецкая и др., 2007;Курилова и др., 2008; Курилова и др., 2011а, б), ФИ3К и ФИ4К (Крутецкая и др., 2008),ключевые ферменты фосфоинозитидного пути передачи сигнала ФЛС и ПКС (Крутецкая и др.,2009), актиновые филаменты (Крутецкая и др., 2011; Курилова и др., 2012б; Kurilova et al., 2013;91Миленина и др., 2014), микротрубочки (Курилова и др., 2012а; Крутецкая и др., 2013; Kurilovaet al., 2013), рецепторы, ассоциированные с гетеротримерными G-белками (Krutetskaya et al.,2014), а также малые G-белки суперсемейства Ras (Крутецкая и др., 2014)..Таким образом, можно заключить, что Са2+-сигнализация, каскад метаболизма АК,актиновый цитоскелет и редокс-регуляция – это системы, которые необходимы дляжизнедеятельности всех типов клеток и играют особую роль в функционировании иммунныхклеток.В связи с этим целью исследовательской работы являлось изучение роли каскадаметаболизма арахидоновой кислоты и элементов актинового цитоскелета (актин-связывающихбелков) в действии препаратов-иммуномодуляторов глутоксим и моликсан на [Ca2+]i вперитонеальных макрофагах крысы.Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:1) изучить участие ключевого «стартового» фермента каскада метаболизма АКфосфолипазы А2 в действии глутоксима и моликсана на [Ca2+]i в макрофагах;2) изучить участие ключевых ферментов каскада метаболизма АК – циклооксигеназ,липоксигеназ и эпоксигеназ (цитохромов Р450) – в регуляции Са2+-ответов, вызываемыхглутоксимом и моликсаном в макрофагах;3) исследовать участие актин-связывающих белков WASP и Arp 2/3-комплекса вдействии препаратов глутоксим и моликсан на [Ca2+]i в перитонеальных макрофагах крысы.923.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ3.1. Объект исследованияОбъектомисследованияслужиликультивируемыерезидентныеперитонеальныемакрофаги крыс линии Wistar (рис. 28). Клетки выделяли из перитонеальной полости крыс(самцов массой 200-300 г) по методу, описанному ранее (Conrad, 1981; Randriamampita,Trautmann, 1987). Сразу после выделения клетки имели сферическую форму и диаметр около 10- 20 мкм. Суспензию клеток помещали в бакпечатки с кварцевыми стеклами (10 х 10 мм).Клетки на стеклах культивировали в среде 199 (рН=7.2) с добавлением сыворотки крови быка(20%), раствора глутамина (3%), пенициллина (100 ед/мл) и стрептомицина (100 мг/мл) втечение 1 – 3 суток при 37°С.
По окрашиванию α-нафтилацетатэстеразой (Monahan et al., 1981)было определено, что по меньшей мере 96% клеток в монослоях являются макрофагами.Эксперименты проводили при комнатной температуре 20 - 22°С на 2-е - 3-и суткикультивирования.Рис. 28. Перитонеальные макрофаги крысыПеритонеальные макрофаги крысы на 2-е сутки культивирования, визуализированныепри помощи микроскопа Leica DM 4000B и специализированной видеокамеры LeicaDFC340FX.933.2. РастворыКварцевые стекла с клетками помещали в экспериментальную камеру, заполненнуюфизиологическим раствором следующего ионного состава: NaCl – 140 мМ, КСl – 5 мМ, CaCl2 –1 мМ, MgCl2 – 1 мМ, HEPES-NaOH - 5 мМ; рН 7,3 - 7,4 (Alonso-Torre, Trautmann, 1993).Бескальциевая среда содержала 0 мМ СаС12 и 1 мМ ЭГТА.Препараты глутоксим и моликсан предоставлялись фирмой «ФАРМА-ВАМ» (СанктПетербург).
Фармакологические агенты индометацин, ацетилсалициловая кислота (аспирин),нордигидрогуаретиковая кислота, каффеиковая кислота, байкалейн, зилеутон, эконазол,проадифен, 4-бромфенацилбромид, вискостатин, СК-0944666, а также флуоресцентный Са2+зонд Fura-2AM предоставлялись фирмой «Sigma-Aldrich» (США).
Коммерческий препаратдексаметазона (4 мкг/мл) предоставлялся фирмой «KRKA» (Словения), а коммерческийпрепарат преднизолона (25 мкг/мл) – фирмой «Takeda Austria GmbH» (Австрия).Маточные растворы глутоксима (50 мг/мл) и моликсана (50 мг/мл) готовили на воде.Маточные растворы ацетилсалициловой кислоты (10 мМ), каффеиковой кислоты (5 мМ) ибайкалейна (5 мМ) готовили на этиловом спирте.
Маточные растворы 4-бромфенацилбромида(10 мМ), индометацина (10 мМ), нордигидрогуаретиковой кислоты (10 мМ), зилеутона (1 мМ),эконазола (5 мМ), проадифена (100 мМ), вискостатина (10 мМ), соединения СК-094666 (100мМ), Fura-2AM (1 мМ) готовили на диметилсульфоксиде.3.3. Измерение внутриклеточной концентрации Са2+ с помощьюфлуоресцентного Са2+-зонда Fura-2AMДля измерения [Ca2+]i использовался флуоресцентный зонд Fura-2AM. Макрофагиинкубировали в течение 45 мин в физиологическом растворе, содержащем 2 мкМ Fura-2AM,при комнатной температуре (20 - 22°С). Стекла с окрашенными клетками отмывалисьфизиологическим раствором и переносились в экспериментальную камеру, расположенную напредметном столике люминесцентного микроскопа.Для выявления и усиления входа Са2+ в клетки в ходе регистрации [Ca2+]i использоваликлассическую схему эксперимента (Са2+-free/ Са2+-reintroduction protocol) (Alonso-Torre,Trautmann, 1993).
Макрофаги инкубировали в номинально бескальциевой среде, затем на нихдействовали глутоксимом или моликсаном, вызывая мобилизацию Са2+ из внутриклеточныхдепо. После добавления в наружную среду 2 мМ Са2+ и восстановления физиологического94градиента концентрации Са2+ наблюдалось быстрое повышение [Ca2+]i, отражающее вход Са2+в клетку.Фармакологические агенты добавляли до введения глутоксима или моликсана(предварительная инкубация) или во время развившегося входа Са2+ из наружной среды.Длярегистрации[Ca2+]iиспользовалиоригинальныеавтоматизированныеэкспериментальные установки на базе люминесцентного микроскопа «Люмам-КФ» (ЛОМО,Санкт-Петербург) и Leica DM 4000B (Leica Microsystems, Германия).3.3.1. Экспериментальная установка на базе люминесцентного микроскопа«Люмам-КФ»В автоматизированной установке на базе люминесцентного микроскопа «Люмам-КФ»(рис.
29) флуоресценцию Fura-2AM возбуждали при 337 нм с помощью азотного лазера ЛГИ503. Лазер располагался сбоку от микроскопа под углом 30° к экспериментальной камере, такчто луч лазера был направлен непосредственно на объект. Интенсивность флуоресценциирегистрировали с помощью спектрофотонасадки СФН-10 при длине волны 510 нм.СигналсфотоэлектронногоумножителяФЭУ-79усиливалсяспециальносконструированным усилителем и регистрировался на компьютере IBM PC с использованиеморигинального программного обеспечения. В экспериментах использовался объектив 10 х сапертурой 0,40. При данном увеличении в площадь фотометрируемого участка попадает 40 - 50клеток.
Для избежания фотовыгорания измерения проводили через каждые 20 с с облучениемобъекта в течение 2,5 с.При обработке результатов значения [Ca2+]i рассчитывались по уравнению Гринкевича(Grynkiewicz et al., 1985):[Са2+]i=Kd (F - Fmin),Fmax - Fгде F – наблюдаемая интенсивность флуоресценции, Fmax – флуоресценция красителя,насыщенного Са2+; Fmin – флуоресценция красителя, свободного от Са2+ (в бескальциевойсреде), Kd - константа диссоциации для комплекса Fura-2AM:Ca2+, которая при 20o C и pH 7,17,2 составляет 135 нМ (Grynkiewicz et al., 1985).95Рис. 29. Схема автоматизированной установки на базе флуоресцентногомикроскопа Люмам КФ для регистрации внутриклеточной концентрации ионов Са2+1 – Экспериментальная камера с клетками.2 - Флуоресцентный микроскоп Люмам КФ.3 - Спектрофотонасадка СФН-10.4 - Блок питания ФЭУ.5 – Шторка.6 - Азотный лазер ЛГИ-503.7 - Блок питания лазера.8 - Усилитель тока ФЭУ.9 - Аналого-цифровой преобразователь (АЦП, 10 разрядов).10 - Блок управления шторкой.11 - Компьютер.12 – Принтер.963.3.2.
Экспериментальная установка на базе флуоресцентного микроскопаLeica DM 4000BВ автоматизированной экспериментальной установкенабазефлуоресцентногомикроскопа Leica DM 4000B (Leica Microsystems, Германия) (рис. 30) возбуждениефлуоресценции объекта производили при длинах волн 340 и 380 нм через объектив 10× сапертурой 8 мм люминесцентного микроскопа. Источником возбуждающего излученияслужила ксеноновая лампа (75 Вт). Для выделения соответствующих участков спектраиспользовали узкополосные оптические фильтры. Эмиссию регистрировали при длине волны510 нм при помощи специализированной видеокамеры Leica DFC340FX. Для выделения света сдлиной волны 510 нм использовали оптический фильтр. Для управления экспериментомиспользовали систему обработки изображения ImageJ (плагин Micro-Manager 1.4).Результатом измерений являлось отношение интенсивностей флуоресценции Fura-2AMпри облучении светом с длиной волны 340 нм к интенсивности флуоресценции при облучениисветом с длиной волны 380 нм (Ratio(F340/F380), где F340 – интенсивность флуоресценцииFura-2AM, связанного с Са2+, а F380 – интенсивность флуоресценции Fura-2AM, не связанногос Са2+), отражающее изменения [Ca2+]i в клетках во время измерений (Bruce, Elliott, 2000; Xie etal., 2002).
Для избежания фотовыгорания измерения проводили через каждые 20 с, облучаяобъект в течение 2 с. В экспериментах применяли объектив 10× с апертурой 8 мм.Статистический анализ проводили с применением критерия t Стьюдента.97Рис. 30. Схема автоматизированной установки на базе люминесцентногомикроскопа Leica DM 4000B для регистрации внутриклеточной концентрации ионов Са2+1 – Ксеноновая лампа (75 Вт).2 – Источник питания ксеноновой лампы (ebx75).3 – Флуоресцентный микроскоп Leica DM 4000B (Leica Microsystems, Германия).4 – Предметный столик микроскопа с экспериментальной камерой.5 – CCD-камера LEICA DFC340FX.6 – Компьютер.
Подключение CCD-камеры осуществляется при помощи интерфейсаIEEE1394. Полученное изображение обрабатывается программой ImageJ (плагин Micro-Manager1.4). Подключение к собственному управляющему блоку микроскопа (7) осуществляется припомощи интерфейса RS232С.7 – Собственный управляющий блок микроскопа Leica DM 4000B, которыйосуществляет автоматическое переключение узкополосных оптических фильтров в ходеэксперимента.984. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ4.1. Влияние препаратов глутоксим и моликсан навнутриклеточную концентрацию Са2+ в макрофагахВ контрольных экспериментах исследовано влияние препаратов глутоксим (динатриеваясоль GSSG c переходным металлом в наноконцентрации) и моликсан (комплекс глутоксима синозином) на [Ca2+]i в резидентных перитонеальных макрофагах крысы.Было показано, что инкубация макрофагов в течение 20 - 23 мин со 100 мкг/млглутоксима (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
