Диссертация (1145903), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Поскольку клеточная мембрананепроницаема для GSH, данный трипептид расщепляется на составные аминокислоты, которыезатем транспортируются в клетку для ресинтеза (Xiong et al., 2011). Так, γ-глутамилтрансфераза – гетеродимерный мембранный гликопротеин – отщепляет от молекулы GSHостатокглутаминовойкислоты,аоставшийсядипептидвпоследствиирасщепляетсяассоциированными с плазмалеммой дипептидазами до свободных аминокислот цистеина иглицина (Xiong et al., 2011).Биосинтез GSH из аминокислот-предшественников происходит практически во всехтипах клеток и включает две АТФ-зависимые ферментативные реакции. Первая катализируетсяферментом γ-глутамилцистеинил-синтазой в присутствии ионов Mn2+ или Mg2+ (Lu, 1999):75L-глутамат + L-цистеин + АТФ → γ-L-глутамил-L-цистеин + АДФ + Фн (Фн –неорганический фосфат).Таким образом, в формировании N-терминальной пептидной связи принимает участие γкарбоксильная группа остатка глутамата, что обеспечивает устойчивость глутатиона кдействию внеклеточных протеаз (Xiong et al., 2011).Первая стадия лимитирует скорость биосинтеза и ингибируется GSH по принципуотрицательной обратной связи.
Вторая стадия протекает с участиме фермента глутатионсинтазы (Lu, 1999):γ-L-глутамил-L-цистеин + L-глицин + АТФ → γ-L-глутамил-L-цистеинил-глицин + АДФ+ Фн.В нормальных условиях в клетке поддерживается высокая концентрация GSH, котораяварьирует в пределах от 0,1 до 10,0 мМ и в 10 – 100 раз превышает содержание GSSG (Hayes,McLennan, 1999). Таким образом, среда в цитозоле имеет восстановленный характер.Окислительный стресс, связанный с различными физиологическими или патологическимипроцессами, приводит к уменьшению соотношения GSH/GSSG и накоплению GSSG в цитозоле(Lu, 1999; Filomeni et al., 2002; Forman et al., 2009).
GSSG является окислителем и потенциальнотоксичен для клетки, но в норме достаточно велика активность глутатион-редуктазы,поддерживающей большую часть глутатиона в восстановленном состоянии. Кроме того,некоторая часть GSSG может удаляться из клетки (Lu, 1999; Filomeni et al., 2002; Forman et al.,2009).Функции GSH в клетке очень разнообразны. Это соединение может выступать в качествекофактора антиоксидантных ферментов, например, селен-содержащих глутатион-пероксидаз(Brigelious-Flohe, 1999) и одного из пероксиредоксинов (пероксиредоксина 6) (Forman et al.,2009).
Кроме того, сам GSH улавливает и ингибирует свободные радикалы и принимает участиев детоксикации ксенобиотиков, а также является источником аминокислоты цистеина (Hayes,McLennan, 1999; Lu, 1999; Forman et al., 2009). Одной из важнейших функций GSH являетсязащита белковых молекул от повреждений в ходе окислительного стресса за счёт Sглутатионилирования–посттрансляционноймодификации,котораязаключаетсявобразования смешанных дисульфидов между SH-группами остатков цистеина белков и GSH(рис.
23) (Biswas et al., 2006; Xiong et al., 2011).Воздействие активных форм кислорода на цистеиновые остатки белковой молекулыможет приводить к образованию тиильных радикалов или сульфеновых производных (Biswas etal., 2006):Белок-S ־+ ROO• → Белок-S• + ROO־Белок-SH + R•/ •OH/ Н2О2 → Белок-SOH + Н2О76В присутствии GSH с участием глутатион-S-трансферазы эти белковые интермедиатытрансформируются в смешанные дисульфиды глутатиона и белка (Biswas et al., 2006; Xiong etal., 2011):Белок-SOH +GSH → Белок-S – SG + Н2О.Восстановление SH-групп белков происходит в результате деглутатионилирования тиол-дисульфидногообменамеждуGSHисмешаннымидисульфидами,которыйобеспечивается белками глутаредоксинами и сульфоредоксинами (Lu, 1999; Xiong et al.,2011):Белок-S - SG + GSH ↔ белок-SH + GSSG.Кроме того, обе окисленные формы глутатиона (GSSG и смешанные дисульфидыглутатиона и белков) могут быть восстановлены с участием NADPH-зависимой GSH-редуктазы(Meister, Anderson, 1983):GSSG + NADPH + H+ → 2 GSH + NADP+.Менее изученной защитной окислительной модификацией белков является Sнитрозилирование, в котором принимают участие SH-группы белков, GSH и активные формыазота (Konorev et al., 2000; Mallis, Thomas, 2000; Forman et al., 2004).
Возможно, в основе Sнитрозилирования лежит транснитрозилирование между нитрозоглутатионом (GSNO) иостатками цистеина белков (Konorev et al., 2000; Mallis, Thomas, 2000):Белок-SH + GSNO → Белок-SNO + GSHВ ходе окислительного стресса в цитозоле происходит накопление GSSG, который такжеможет обеспечивать S-глутатионилирование белков, таким образом, защищая белковыемолекулы от других, необратимых, форм окисления (Dominici et al., 1999; Lu, 1999). В этомслучае GSSG вступает в тиол-дисульфидный обмен с SН-группами остатков цистеина собразованием смешанных дисульфидов:Белок-SH + GSSG → Белок-S - SG + GSHНарядусзащитойSH-группбелковвходеокислительногостресса,S-глутатионилирование и S-нитрозилирование играют важную роль в редокс-регуляции работывнутриклеточных белков и экспрессии генов (Xiong et al., 2011).
Так, весь дисульфидсодержащий протеом – совокупность белков клетки, содержащих дисульфидные связи, - можноразделить на два субпротеома: структурный (structural) и редокс-чувствительный (redoxsensitive) (Wouters et al., 2010). Активность белков, относящихся к редокс-чувствительномусубпротеому, может регулироваться за счёт S-глутатионилирования редокс-чувствительныхостатков цистеина (Xiong et al., 2011).
К редокс-чувствительному субпротеому относятся белкицитоскелета; ферменты, участвующие в процессах энергетического метаболизма; ферменты сантиоксидантной активностью; белки, шапероны и шаперонины; протеинкиназы и другие77молекулярные участники процессов внутриклеточной (в том числе кальциевой) сигнализации(Xiong et al., 2011).Рис.
23. Цикл S-глутатионилирования (по Xiong et al., 2011, с модиф.)Остатки цистеина белков, имеющие низкую константу кислотности (рК), являютсямишенями для активных форм кислорода (ROS) и азота (RNS) во время окислительногостресса. Они могут быть окислены до сульфеновых, сульфиновых и сульфоновых кислот.Сульфеновые и сульфиновые производные подвергаются S-глутатионилированию с участиемглутатион-S-трансфераз (glutathione-S-transferase, GSTP), реже – с участием глутаредоксинов(glutaredoxin, Grx) или неэнзиматическим путём. Последующее деглутатионилирование свосстановлением SH-групп происходит благодаря глутаредоксинам или сульфоредоксинам(Srx).Известно, что GSH не проникает через клеточную мембрану.
Однако было выявлено, чтовоздействие на эритроциты внеклеточного GSH приводило к повышению его внутриклеточнойконцентрации (Ciriolo et al., 1993). Механизм, которым можно объяснить это явление, – этотиол-дисульфидный обмен в цепочке остатков цистеина трансмембранных белков, которыйзапускается взаимодействием между GSH и внеклеточными остатками цистеина белковоймолекулы. Предполагается, что сульфгидрильные группы белков в плазмалемме выполняютроль сенсоров, которые реагируют на изменения редокс-статуса внеклеточной среды и78передают редокс-сигнал внутриклеточным молекулам, влияя при этом на редокс-статус внутриклетки (Filomeni et al., 2002; Townsend, Tew, 2009).В то же время обработка GSSG клеток U937 приводит к существенному снижениювнутриклеточной концентрации GSH и повышению содержания смешанных дисульфидовмежду глутатионом и белками, причём концентрация самого GSSG остаётся неизменной(Filomeni et al., 2002).
Поскольку GSSG, как и GSH, не способен проникать черезплазматическую мембрану, вероятно, его эффект обусловлен воздействием на экспонированныево внешнюю среду остатки цистеина трансмембранных белков (рецепторов) (Filomeni et al.,2002). При этом тиол-дисульфидный обмен в цепочке остатков цистеина белка передаёт сигналв цитоплазму. Показано, что воздействие внеклеточного GSSG приводит к гибели раковыхклеток и супрессии опухолей (Filomeni et al., 2002). Таким образом, GSH и GSSG могутоказывать рецептор-опосредованное воздействие на внутриклеточные процессы.2.4.2. Редокс-регуляция активности клеточных белковСа2+-сигнализацияОкисляющие агенты играют важную роль в регуляции процессов Са2+-сигнализации(Ermak, Davies, 2002).
Показано, что окислительный стресс, связанный с воздействием наклетки различных окисляющих агентов, может приводить к быстрому повышению [Ca2+]i,обусловленному как мобилизацией Са2+ из внутриклеточных депо (ЭР, СР), так и входом Са2+из наружной среды (Ermak, Davies, 2002).Многие белки, участвующие в процессах Са2+-сигнализации, имеют высокую редоксчувствительность,котораясвязанасналичиемостатковцистеина,доступныхдляокислительно-восстановительных модификаций (Nunes, Demaurex, 2014).Рецепторы инозитол-1,4,5-трифосфата. IP3-чувствительный канал Са2+-выброса (IP3рецептор), локализованный в мембране ЭР, содержит ключевые остатки цистеина, которыеявляются мишенями для S-глутатионилирования (Higo et al., 2005; Kang et al., 2008). Показано,что S-глутатионилирование IP3-рецептора под действием диамида активирует мобилизациюСа2+ из внутриклеточных депо в клетках эндотелия аорты (Lock et al., 2012).Один из регуляторных механизмов связан с петлёй L3-1 IP3-рецептора, локализованной впросвете ЭР.
Так, показано, что белок ERp44 (endoplasmic reticulum luminal protein 44; белокпросвета ЭР 44) из семейства тиоредоксинов способен непосредственно взаимодействовать спетлёйL3-1субъединицыIP3-рецептора,локализованноймеждупорообразующимитрансмембранными сегментами S5 и S6 и обращённой в просвет ЭР (Higo et al., 2005).Установлено, что данное белок-белковое взаимодействие приводит к ингибированию79активности IP3-чувствительного Са2+-канала и является редокс-зависимым: необходимо, чтобыостатки цистеина в петле L3-1 находились в восстановленном состоянии (Higo et al., 2005).Редокс-потенциал внутри ЭР оказывает существенное влияние на конформацию петлиL3-1 IP3-рецептора (Kang et al., 2008).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
