Диссертация (1145903), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Так, опосредованное GSSG окисление остатков Cys-34 иCys-42 в петле L3-1 приводит к образованию между ними дисульфидной связи. В результатеокисления во фрагменте Cys-34 - Cys-42 образуются локальные спиральные структуры и, какследствие, происходит снижение подвижности петли L3-1 (рис. 24) (Kang et al., 2008).Вероятно, образование дисульфидной связи между Cys-34 и Cys-42 приводит к тому, чтоучасток белка между ними оказывается недоступен для взаимодействия с регуляторнымифакторами, действующими со стороны просвета ЭР. В частности, при этом подавляетсясвязывание ингибирующего белка ERp44 с петлёй L3-1 (Kang et al., 2008).
Таким образом,окисление остатков цистеина IP3-рецептора способствует увеличению активности канала Са2+выброса.Са2+-АТФазыэндоплазматическогоретикулума.Различныеизоформыэндоплазматических Са2+-АТФаз (SERCA) содержат от 22 до 28 остатков цистеина, которыемогут быть мишенями для действия окислителей (Nunes, Demaurex, 2014). Эффект зависиттакже от типа модификации, поскольку, например, S-глутатионилирование остатка Cys-674повышает активность АТФазы, в то время как сульфонилирование остатков цистеина (в томчисле Cys-674) ингибирует SERCA и приводит к деградации белка (Nunes, Demaurex, 2014).Интересные результаты получены на ооцитах Xenopus, экспрессирующих SERCA2bчеловека и ERp57 (endoplasmic reticulum luminal protein 57; белок просвета ЭР 57) человека –оксидоредуктазу, локализованную в полости ЭР (Li, Camacho, 2004).
Показано, что в условияхокислительного стресса ERp57 стимулирует образование дисульфидной связи между остаткамиCys-875 и Cys-887 АТФазы, обращёнными в просвет ЭР, что приводит к ингибированиюSERCA (Li, Camacho, 2004).80Рис. 24. Конформационныеизменения в петле L3-1 IP3-рецепторапри изменении редокс-статуса(по Kang et al., 2008)Взаимодействие петли L3-1 сокислителями приводит к образованиюдисульфидной связи между остаткамиCys-34 и Cys-42. В результате в цепиаминокислотных остатков между Cys-34 иCys-42 образуется спиральная структура, иданный фрагмент оказывается недоступендля действия регуляторных факторов.Cytosol - цитозоль; Lumen –просвет; Oxidation – окисление.Целый ряд экспериментальных данных свидетельствует о том, что активность ключевыхучастников депо-зависимого входа Са2+ - белков STIM, Orai, TRP – также регулируется сучастием окисляющих агентов (Nunes, Demaurex, 2014).Белки STIM1, экспрессирующиеся в клетках человека и мыши, содержат 4 остаткацистеина (Bogeski et al., 2012).
Cys-49 и Cys-56 – высококонсервативные остатки, которыелокализованы рядом с Са2+-связывающим участком «EF-рука» (EF-hand) в N-терминальномдомене, обращённом в просвет эндоплазматического ретикулума. Cys-227 расположен нацитоплазматическомконцетрансмембранногосегментаSTIM1,аCys-437–вцитоплазматическом домене, взаимодействующем с белками Orai (домен CAD) (Bogeski et al.,2012).81Установлено, что STIM1 подвергается S-глутатионилированию по консервативномуостатку цистеина Cys-56 в ходе окислительного стресса, вызываемого бактериальнымлипополисахаридом или бутатионин-сульфоксимином в В-лимфоцитах (Hawkins et al., 2010).Этот аминокислотный остаток локализован около Са2+-связывающего домена «EF-рука»,который экспонирован в просвет эндоплазматического ретикулума.
S-глутатионилированиеCys-56 снижает сродство белков STIM1 к Са2+ и облегчает их олигомеризацию, что приводит кзапуску входа Са2+ независимо от опустошения Са2+-депо (Hawkins et al., 2010). При этомзамена Cys-56 на неполярный остаток аланина в белке STIM1 приводит к постояннойактивности последнего и стабильной активации депо-зависимого входа Са2+ (Hawkins et al.,2010).Белки Orai (Orai1, Orai2), формирующие пору депо-зависимых Са2+-каналов, такжеявляются редокс-чувствительными благодаря наличию трёх консервативных остатковцистеина: Cys-126 и Cys-143 в трансмембранном сегменте ТМ2 и Cys-195 на экстраклеточномконце трансмембранного сегмента ТМ3 (Bogeski et al., 2010, 2012; Nunes, Demaurex, 2014).Orai3 не имеет Cys-195, однако содержит два дополнительных остатка цистеина вовнеклеточной петле между трансмембранными сегментами ТМ3 и ТМ4 (Bogeski et al., 2012).Результаты биохимических исследований свидетельствуют о том, что именно Cys-195является основным сенсором редокс-статуса внеклеточной среды (Bogeski et al., 2012).
Сиспользованием метода patch-clamp и визуализации внутриклеточного Са2+ было показано, чтовоздействие Н2О2 на уже активированные комплексы Orai1 и STIM1 в Т-лимфоцитах человека иклетках НЕК293 не оказывает воздействия на депо-зависимый вход Са2+ с их участием.Предварительная инкубация с Н2О2 ингибирует активацию Orai1, но не Orai3 (Bogeski et al.,2010). Мутации с заменой трёх остатков цистеина на остатки аланина снижают редоксчувствительность белков Orai1, причём мутация Cys-195 Ala имеет наиболее сильный эффект(рис.
2В) (Bogeski et al., 2010). В то же время белки Orai3, которые не содержат Cys-195,нечувствительны к редокс-модификациям (Bogeski et al., 2010).TRP-белки. Активность многих TRP-каналов также модулируется с участиемокисляющих и восстанавливающих агентов (Takananshi, Mori, 2011; Kozai et al., 2014). Так,каналы TRPС5, TRPV1, TRPA1 способны непосредственно активироваться окисляющимиагентами, взаимодействующими со свободными SH-группами остатков цистеина белков (рис.25) (Song et al., 2011; Takananshi, Mori, 2011; Kozai et al., 2014).Показано, что активность каналов TRPC5 мыши, экспрессированных в клетках НЕК293,регулируется с участием внутриклеточного медиатора NO посредством S-нитрозилированияфункционально важных остатков цистеина Cys-553 и Cys-558, локализованных на N-концепорообразующего участка между пятым и шестым трансмембранными сегментами белка82(Yoshida et al., 2006; Takananshi, Mori, 2011).
S-нитрозилирование приводит к образованиюдисульфидной связи между этими аминокислотными остатками и, как следствие, к активацииканалов TRPC5 (Yoshida et al., 2006; Takananshi, Mori, 2011).Каскад метаболизма арахидоновой кислотыАрахидоновая кислота и продукты её метаболизма являются биологически активнымимолекулами, и их продукция в клетке регулируется с участием различных факторов. Вчастности, активность ферментов, принимающих участие в каскаде метаболизма АК, можетмодулироваться с участием восстанавливающих и окисляющих агентов.Рис.
25. Модель активации каналов TRPC5 с участием NO(по Takananshi, Mori, 2011)NO взаимодействует со свободной SH-группой остатка Cys-553 с образованием Sнитрозотиола, что приводит к конформационным изменениям в порообразующем модуле иоткрыванию канала. Модифицированный Cys-553 затем подвергается нуклеофильной атаке состороны SH-группы остатка Cys-558, и образующийся дисульфидный мостик стабилизируетканал в открытом состоянии.83Фосфолипазы А2. Установлено, что АФК выступают в качестве внутриклеточныхсигнальных посредников, причём их эффект может имитировать действие ростовых факторов(van Rossum et al., 2004). В частности, показано, что АФК оказывают активирующеевоздействие на ключевой фермент каскада метаболизма АК - ФЛА2 (van Rossum et al., 2004).Так, воздействие пероксида водорода и гидропероксида кумола на фибробласты линии Her14приводит к быстрой активации Са2+-зависимой цитоплазматической ФЛА2 (van Rossum et al.,2004).
Вероятно, данный эффект обусловлен тем, что АФК запускают перекисное окислениелипидов мембран, что приводит к изменению вязкости цитоплазматической мембраны иповышению доступности АК в составе мембранных липидов для цФЛА2. Установлено также,что АФК могут активировать цФЛА2 в перитонеальных макрофагах мыши (Goldman et al.,1992), iPLA2 в клетках стромы матки крысы (Birbes et al., 2000) и Са2+-независимыемитохондриальные ФЛА2 (mt-iPLA2) из кардиомиоцитов крысы (Jezek et al., 2010).Показано, что для функциональной активности цФЛА2 важное значение имеют остаткицистеина Cys-324 и Cys-321, которые могут являться мишенями для окислительныхмодификаций (Li et al., 1996). Кроме того, потенциальными мишенями для редокс-регуляцииявляются остатки цистеина таких ферментов каскада метаболизма АК, как циклооксигеназы(Cys-313, Cys-540), цитохромы Р450 (Cys-225, Cys-239) и липоксигеназы (Kennedy et al., 1994;Smith et al., 1996; Hafner et al., 2011; VandenBrick et al., 2012).Липоксигеназы.
Различные изоформы ЛОГ содержат большое количество остатковцистеина и, как следствие, имеют высокую редокс-чувствительность. Так, GSSG вызывает Sглутатионилирование очищенной 12-ЛОГ in vitro, а также 12-ЛОГ, экспрессированной внейронах гиппокампа мыши, что приводит к активации фермента (Park et al., 2009). Показано,что увеличение концентрации GSSG в цитоплазме нейронов и активация 12-ЛОГ играютключевую роль в нейротоксическом эффекте медиатора глутамата (Park et al., 2009).Изменение редокс-баланса цитозоля – важный фактор, регулирующий активность ЛОГ вразличных типах иммунных клеток. Установлено, что окисляющие агенты (например, диамид)стимулируют окисление АК с участием 5-ЛОГ в полиморфноядерных лейкоцитах человека(Hatzelmann, Ullrich, 1987).
По-видимому, данный эффект непосредственно связан соснижением концентрации GSH в цитозоле и изменением редокс-статуса клеток. Аналогичныерезультаты были получены при исследовании активации 5-ЛОГ в В-лимфоцитах человека(Jakobsson et al., 1992).5-ЛОГ может образовывать димеры и олигомеры за счёт дисульфидных связей междуключевыми остатками цистеина молекулы фермента (Hafner et al., 2011). Однако полнойкаталитической активностью обладает именно мономер.
Показано, что S-глутатионилирование845-ЛОГ человека, индуцированное диамидом или глутатионом, приводит к тому, что ферментнаходится преимущественно в активной мономерной форме (Hafner et al., 2011).Актиновый цитоскелетАктинподвергаетсяцеломурядупосттрансляционныхмодификаций,включаяацетилирование, фосфорилирование, метилирование, а также редокс-модификации остатковсеросодержащих аминокислот цистеина и метионина (Gellert et al., 2015). Большинство редоксмодификаций актина, включая S-глутатионилирование и S-нитрозилирование, влияют наполимеризацию и деполимеризацию филаментов, а также взаимодействие с актинсвязывающими белками (Dalle-Donne et al., 2003 a,b; Gellert et al., 2015).Основной мишенью S-глутатионилирования и S-нитрозилирования в молекуле актинаявляется SH-группа остатка Cys-374, локализованного в С-терминальном участке (Dalle-Donneet al., 2003 a).
Так, S-глутатионилирование остатка Сys-374 в мономере α-актина из скелетныхмышц кролика приводит к снижению уровня полимеризации актина по сравнению с нативнымбелком, причем происходит ингибирование стадии элонгации. Деглутатионилирование актинаполностью восстанавливает способность α-актина к полимеризации, что свидетельствует обобратимости модификации (Dalle-Donne et al., 2003 a).В молекуле немышечного β/γ-актина, помимо остатка Cys-374, наиболее реакционноспособным является остаток цистеина Cys-272, который отсутствует в эквивалентной позиции вα-актине и изоформах актина, экспрессирующихся в клетках беспозвоночных (Lassing et al.,2007). Установлено, что окисление SH-группы остатка Cys-272 β/γ-актина до сульфиновойкислоты или его S-глутатионилирование in vitro также приводит к полной потере способности кполимеризации, однако активность белка восстанавливается при действии тиоредоксинов(Lassing et al., 2007).S-глутатионилированиеидеглутатионилированиепредставляютсобоймощныймеханизм регуляции полимеризации актина в ответ на физиологические стимулы (Wang et al.,2001).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
