Диссертация (1145903), страница 20
Текст из файла (страница 20)
33б). Аналогичныерезультаты получены для препарата моликсан (рис. 35б).Также установлено, что преинкубация макрофагов в течение 5 минут со 100 мкМацетилсалициловой кислоты вызывает практически полное подавление мобилизации Са2+ издепо и входа Са2+, индуцированных 100 мкг/мл глутоксима (рис. 34б) или моликсана (рис. 35в).Кроме того, показано, что добавление 40 мкМ индометацина на фоне развившегосявхода Са2+, вызываемого 100 мкг/мл глутоксима (рис.
36б) или моликсана (данные непредставлены), приводит к значительному подавлению входа Са2+ в макрофагах. Введение 200мкМ аспирина на фоне развившегося входа Са2+, индуцированного глутоксимом (рис. 36б) илимоликсаном (результаты не представлены), также вызывало подавление входа Са2+, однако104эффективность подавления была меньше. В среднем подавление входа Са2+, индуцируемогоглутоксимом, составило для аспирина 26,2 ± 3,3% (по данным 8 экспериментов), дляиндометацина - 56,8 ± 4,7% (по данным 9 экспериментов).
Данные о влиянии ингибиторов ЦОГна развившийся вход Са2+, индуцированный глутоксимом и моликсаном, представлены втаблице 2.Полученные результаты свидетельсвуют о том, что ферменты и/или продуктыциклооксигеназного пути метаболизма АК играют важную роль в запуске фазы мобилизацииСа2+ из депо, а также генерации и поддержании депо-зависимого входа Са2+, индуцируемыхглутоксимом или моликсаном в макрофагах.Таблица 2. Влияние ингибиторов каскада метаболизма арахидоновойкислоты на развившийся депо-зависимый вход Са2+, индуцируемыйглутоксимом и моликсаномФармакологический МишеньагентдействияАспирин (200 мкМ)ЦиклооксигеназыИндометацин (40 мкМ)ЦиклооксигеназыНордигидрогуаретиковаякислота (30 мкМ)ВселипоксигеназыКаффеиковая кислота (40 5-липоксигеназамкМ)Зилеутон (4 мкМ)5-липоксигеназаБайкалейн (40 мкМ)12-липоксигеназаЭконазол (5 мкМ)Цитохромы Р450(эпоксигеназы)Проадифен (100 мкМ)Цитохромы Р450(эпоксигеназы)ПодавлениевходаСа2+,индуцированногоглутоксимом, %ПодавлениевходаСа2+,индуцированногомоликсаном, %26,2±3,3(по данным 8экспериментов)56,8±4,7(по данным 9экспериментов)31,7±5,8(по данным 7экспериментов)31,2±9,1(по данным 8экспериментов)41,8±9,3(по данным 11экспериментов)60,5±8,9(по данным 7экспериментов)35.8 ± 5.0% (поданным 6экспериментов)37.5 ± 4.2%(по данным 5экспериментов)22,8±5,5(по данным 8экспериментов)53,5±9,9(по данным 9экспериментов)32,8±3,1(по данным 7экспериментов)30,2±8,9(по данным 8экспериментов)45,9±9,7(по данным 11экспериментов)67,1±9,6(по данным 7экспериментов)21,8 ± 4,3 % (поданным 6экспериментов)38,1 ± 3,9 %(по данным 5экспериментов)1052+Рис.
33. Влияние индометацина на увеличение [Ca ]i, вызываемое глутоксимом вмакрофагахЗдесь и далее на рис. 34, 35, 37 – 41, 50, 51 по оси ординат – внутриклеточная концентра2+2+ция Са в нМ ([Ca ]i), по оси абсцисс – время в мин.а – макрофаги инкубировали в течение 20 мин со 100 мкг/мл глутоксима в номинальнобескальциевой среде. Затем вход Са2+ инициировали добавлением в наружную среду 2 мМ Са2+;б – клетки инкубировали в течение 5 мин с 20 мкМ индометацина, затем добавляли 100мкг/мл глутоксима, через 15 мин вход Са2+ инициировали введением в наружную среду 2 мМСа2+.1062+Рис.
34. Влияние ацетилсалициловой кислоты (аспирина) на Са -ответы, индуцируемые глутоксимом в макрофагахПо вертикали и горизонтали – то же, что на рис. 33.а – макрофаги инкубировали в течение 20 мин со 100 мкг/мл глутоксима в номинально2+2+бескальциевой среде, затем вход Са инициировали добавлением в наружную среду 2 мМ Са ;б – клетки инкубировали в течение 5 мин со 100 мкМ аспирина, затем добавляли 100мкг/мл глутоксима и через 20 мин вход Са2+Са .2+инициировали введением в наружную среду 2 мМ1072+Рис. 35. Влияние аспирина и индометацина на увеличение [Ca ]i , запускаемое моликсаном в макрофагахПо вертикали и горизонтали – то же, что на рис. 33.а - макрофаги инкубировали в бескальциевой среде со 100 мкг/мл моликсана в течение2+20 мин до введения 2 мМ Са ;б – клетки предварительно инкубировали с 40 мкМ индометацина в бескальциевой средев течение 5 мин до введения 100 мкг/мл моликсана, через 20 мин после введения моликсана в2+наружную среду добавляли 2 мМ Са ;в – клетки инкубировали в бескальциевой среде с 100 мкМ аспирина в течение 5 мин довведения 100 мкг/мл моликсана, через 20 мин после введения моликсана, в наружную среду до2+.бавляли 2 мМ Са .108Рис.
36. Влияние ингибиторов циклооксигеназ на развившийся депо-зависимыйвход Са2+, вызываемый глутоксимом в макрофагахПо вертикали и горизонтали – то же, что на рис. 32.Макрофаги инкубировали в течение 22 - 25 мин со 100 мкг/мл глутоксима в номинальнобескальциевой среде, затем вход Са2+ инициировали добавлением в наружную среду 2 мМ Са2+.Во время развившегося входа Са2+ добавляли 200 мкМ аспирина (а) или 40 мкМ индометацина(б).109Результаты согласуются с данными, полученными ранее на кафедре биофизики СПбГУ,о влиянии индометацина и аспирина на Са2+-сигналы, индуцированные пуринергическимиагонистами АТФ и УТФ, а также ингибиторами SERCA тапсигаргином и циклопьязониковойкислотой в перитонеальных макрофагах крысы (Крутецкая и др., 2000). Так, предварительнаяинкубация клеток с индометацином или аспирином вызывала почти полное подавление входаСа2+, индуцированного АТФ, УТФ, тапсигаргином или циклопьязониковой кислотой(Крутецкая и др., 2000).
Введение индометацина или аспирина на фоне развившегося входаСа2+, индуцированного этими агентами, также приводило к подавлению входа Са2+ вмакрофагах. Данные результаты позволили предположить, что продукты циклооксигеназногопути окисления АК принимают участие в активации депо-зависимого входа Са2+ вперитонеальных макрофагах крысы (Крутецкая и др., 2000).Влияние продуктов циклооксигеназного пути метаболизма АК на мобилизацию Са2+ извнутриклеточных депо показано на тромбоцитах человека, для которых было установлено, чтоэкзогенная АК в различных концентрациях индуцирует мобилизацию Са2+ из депо (Alonso et al.,1990).
Данный эффект подавлялся при предварительной инкубации с ацетилсалициловойкислотой и имитировался агонистом рецепторов ПГ-Н2/ТК-А2 соединением U46619.Полученные данные позволили предположить, что активирующее влияние АК на фазумобилизации Са2+ опосредовано продуктами циклооксигеназ (ПГ и/или ТК) (Alonso et al., 1990).Полученные нами результаты также согласуются с данными исследований Са2+сигнализации в опухолевых клетках.
Установлено, что структурно различные ингибиторы ЦОГиндометацин, аспирин и ибупрофен могут оказывать противоопухолевое действие, ускоряяапоптоз и ингибируя пролиферацию и миграцию раковых клеток (Kokoska et al., 2000; Guo etal., 2013). Вероятно, данный эффект связан с их действием как на ЦОГ, так и на процессывнутриклеточной Са2+-сигнализации. Так, на клетках эпидермоидной карциномы человекалинии А431 и клетках карциномы прямой кишки человека (Caco-2) было установлено, чтоданные фармакологические агенты подавляют вход Са2+, активируемый EGF (Kokoska et al.,2000; Guo et al., 2013).
Кроме того, показано, что индометацин, аспирин и ибупрофензначительно уменьшают депо-зависимый вход Са2+, запускаемый тапсигаргином в клеткахжелудка человека (Kokoska et al., 1998). Эти результаты свидетельствуют о том, чтоциклооксигеназный путь окисления АК участвует в регуляции входа Са2+ в клетки как в норме,так и при патологии (Kokoska et al., 1998, 2000; Guo et al., 2013)Следуетотметить,чтоингибиторыЦОГиндометациниаспиринобладаютпротивовоспалительным, анальгетическим и жаропонижающим эффектами и входят в составнестероидных противовоспалительных препаратов (табл.
1). В связи с этим полученные110результаты свидетельствуют о нежелательности совместного клинического примененияглутоксима и моликсана с лекарственными средствами на основе индометацина и аспирина.4.4. Влияние ингибиторов липоксигеназ на Са2+-ответы,вызываемые глутоксимом и моликсаномОсновной изоформой ЛОГ, экспрессирующейся в макрофагах и других иммунныхклетках, является 5-ЛОГ, которая окисляет АК с образованием ЛТ – ключевых медиаторов,участвующих в запуске и развитии воспалительных и аллергических реакций (Kuhn et al., 2015).Также важную роль в макрофагах играет 12/15-ЛОГ, продукты которой (в том числе липоксинА4) напротив, выполняют противовоспалительную и цитопротекторную функцию (Krönke et al.,2009).Для выявления возможного участия липоксигеназного пути окисления АК в действииглутоксимаимоликсанана[Ca2+]i вмакрофагахбылииспользованыследующиефармакологические агенты:1) неселективный ингибитор липоксигеназ нордигидрогуаретиковая кислота (НДГК);2) селективные ингибиторы 5-ЛОГ каффеиковая (3,4-дигидроксициннамовая)кислота и зилеутон;4) селективный ингибитор 12-ЛОГ флавоноид байкалейн.Структура фармакологических агентов представлена в таблице 1.В настоящей работе было установлено, что предварительная инкубация перитонеальныхмакрофагов крысы в течение 5 мин с 10 мкМ НДГК до введения глутоксима (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
