Диссертация (1145858), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Масштабная линейка - 10 мкм.Таким образом, проведенные исследования с использованием конфокальной микроскопии,позволили изучить локализацию бактериальных эндофитных сообществ, состоящими из102представителей различных таксономических единиц эубактериального царства, внутритканей сфагновых мхов.3.3. Культивируемые бактериальные эндофиты сфагнума: характеристика составапопуляций и перспективные штаммы – обладатели комплекса хозяйственно-ценныхсвойствПоскольку растения сфагнумов обладают весьма тонкой и сложной морфологическойструктурой, выделение культивируемых форм бактериальных эндофитов из их тканейсоставляет определенные сложности.
Прежде всего, необходимо было оптимизироватьпротокол поверхностной стерилизации этих растений. При выборе стерилизующего агентамы остановились на использовании именно перекиси водороду по ряду причин: высокаяэффективность дезинфекции поверхности растений, полнота и быстрота удаления агента припоследующем отмывании, отсутствие каких либо продуктов распада, способных оказыватьвлияние на развитие бактерий. Использование этанола в протоколе стерилизации, повидимому, не было бы обосновано, поскольку привело к обезвоживанию гиалоцитов,попаданию стерилизующего агента внутрь тканей и последующей гибели эндофитныхбактериальных ассоциантов. Другие стерилизующие агенты, такие как гипохлорит Na иразличные коммерческие продукты на его основе, а также хлорсодержащие продукты ихраспада, плохо удаляются при отмывании растений, а их остатки могли бы вызывать гибельвыделяемых бактерий при последующих манипуляциях.
Продолжительность экспозиции(выдержки в стерилизующем агенте) была также оптимизирована, 5-и минутная экспозициядостаточна для достижения необходимых условий поверхностной стерилизации растений.Таким образом, был получен протокол поверхностной стерилизации растений сфагнума,позволяющий полностью подавить всю их поверхностную микрофлору, но при этомсохранить в жизнеспособном состоянии клетки бактериальных эндофитов, населяющихвнутренние ткани растений.При подборе питательной среды выбор пал на среду R2A, как рекомендованную впредыдущих исследованиях. Данная среда считается не богатой и характеризуетсяминимальным содержанием всех необходимых компонентов для развития гетеротрофныхэндофитныхбактерий.Действительно,вклассическихисследованияхсредаR2Aиспользуется для выделения бактерий из чистой воды и водных экосистем, и поэтому можетбыть успешно применена для выделения эндофитов, так как содержание гиалиновых клетоксфагнума очень близко составу воды природных биотопов.
Показатель pH среды был снижендо 5,5, усредненному значению кислотности воды изучаемых болотных экосистем. При103выделении культуры целлюлозолитических бактерий также использовали подкисленнуюмодифицированную среду Гетченсона, с показателем pH, близким этому показателюболотной воды (см.
п. 2.3.1.). Характерными параметрами культивирования являлисьинкубацияповерхностныхпосевовприсниженнойтемпературе(20°С)иболеепродолжительном периоде времени (5 суток) для достижения возможно более полногопрорастания всех колониеобразующих единиц.3.3.1.
Культурально-морфологические свойства выделенных изолятов бактерийВсего в ходе работы из тканей сфагновых мхом S. fallax и S. magellanicum, отобранных натерритории Австрийских Альп, Ленинградской области, Западной Сибири, было выделеноболее 400 изолятов культивируемых форм эндофитных бактерий. Были охарактеризованы ихкультуральные и морфологические свойства. Большинство выделенных бактерий грамотрицательные (более 98%) округлые, овальные клетки или короткие палочки, оченьмелкие (<1.5мкм),которые формировалина среде R2Aбыстрорастущеелибомедленнорастущие, плоские и стелящиеся, прозрачные или полупрозрачные колонии,окрашенные иногда довольно ярко, красного, фиолетового, розового, желтого, оранжевогоцветов, либо бесцветные, бежевые или мутно-белые. Общая численность микроорганизмов,выделяемых на питательные среды варьировала в диапазоне 105-106 КОЕ/г растительнойткани.
На безазотной среде рост азотфиксирующих и олигонитрофильных бактерий былдовольно обилен, однако число морфотипов невелико и составило не более 5. Ониформировали на среде прозрачные, неокрашенные, слизистые колонии среднего размера,стелящиеся по поверхности агара, либо округлые и выпуклые.Характерной особенностью следует отметить практически полное отсутствие средивыделенных изолятов грамположительных спорообразующих бактерий р. Bacillus: быловыделено 2 штамма представителей этого рода. Причины такого явления могут быть скрытыв высокой переувлажненности болотных экосистем и условиями обитания сфагнов, либоэволюционно более позднем появлении споровых форм бактерий, когда основыфункционирования симбиоза между сфагнами и грамотрицательными микроорганизмамиужесложились.Посколькуспорообразованиесформировалосьубактерийкакприспособление к неблагоприятным условиям среды, прежде всего недостатку влаги исвязанному с ним пересыханию клеток, то логично предположить в условиях, когда растениееще только переходит к наземному образу жизни и большая часть его находится в воде,растительно-микробныйсимбиозбудетвозникатьсмикроорганизмами,неподвергающимися пересыханию и находящимися в водной среде.
Такими эффективными104микроорганизмами, сформировавшими симбиотические отношения со сфагнами, сталипредставители грамотрицательных бактерий.Методом накопительной культуры на жидкой минеральной среде с добавлением целлюлозыбыла выделена целлюлозолитическая ассоциация, которая через 14 дней инкубациипрактически полностью разрушала субстрат по своей структуре и физическим свойства; врезультате сама накопительная культура представляла смесь культуральной жидкостижелтого цвета и остатков целлюлозных волокон и была включена в последующую работу.Микроскопическое исследование культуральной жидкости с остатками целлюлозноговолокна показало, что целлюлозные волокна активно колонизируются комплексоммикроорганизмов, представленных разными морфологическими типами, основу которогосоставляют грамотрицательные неспорообразующие палочки различной морфологии и кокки(рис 3.5.).
Методом последовательных серийных разведений и последующего высева наагаризованную среду Гетченсона с 1% микрокристаллической целлюлозы ассоциация быларазделена на 5 доминантных бактериальных изолятов, каждый из которых был способенрасти в чистой культуре отдельно от остальных. По результатам молекулярно-генетическойидентификации установлено, что в состав сообщества входят микроорганизмы, сильноотличающиеся по своему таксономическому положению: Bacillus cereus, Variovorax sp.,Delftia sp., Flavobacterium sp., Rhodococcus erythropolis.Рис. 3.5. Аэробное целлюлозолитическое сообщество микроорганизмов, выделенное изтканей сфагнового мха S.
fallax: A. – Колонизация бактериями волокон целлюлозы; B. Жидкая культура целлюлозолитического сообщества на 14 сутки роста (на снимке – активноразвивающиесяцеллюлозолитическиецеллюлозного волокна). 1000Х.микроорганизмыиостаткидеградированного1053.3.2. Таксономический состав эндофитных бактериальных популяций Sphagnum fallaxи S.
magellanicumМолекулярно-генетическая идентификация на основании анализа фрагментов гена 16S рРНКс использованием программ BLAST и RDP выявила широкое разнообразие выделенныхмикроорганизмов.Основу бактериальных популяций, культивируемых и способных расти на поверхностиагаризованых сред, составляют грамотрицательные бактерии (рис. 3.6.-3.9.). Полученныеданные показывают значительное разнообразие таксонов, выделяемых из сфагновых мхов.Опираясь на представленные результаты, в видовом составе бактериальных сообществ,ассоциированныхсосфагновымимхами,можновыделитьследующиеосновныетаксономические ветви. Класс Gammaproteobacteria порядок Enterobacteriales включалпредставителей родов Serratia, Enterobacter и ряд других.
Ряд штаммов, отнесенных кусловно-патогенным формам животных и растений, данного таксона был исключен изпоследующей работы; доминирующим видом, выделяемым как из S. fallax, так и из S.magellanicum, являлся Serratia plymuthica.Другой не менее заметной таксономической ветвью были представители порядкаBurkholderiales, разделенной на две основные доминанты: семейство Oxalobacteraceae,представленное Collimonas spp., и семейство Burkholderiaceae, представленное Burkholderiaspp. Среди минорных видов отмечено присутствие Janthinobacterium sp., Pandorea sp.
и др.Фила Bacteroidetes представлена родами Flavobacterium, Pedobacter, Chryseobacterium.Характерной особенностью здесь следует считать наличие представителей Flavobacterium sp.в бактериальных популяциях сфагновых мхов различного географического происхождения,которые формировали на средах характерные ярко-желтые колонии. Возможно, что данныйвид флавобактерий является специфичным для сфагновых мхов.КнаиболеекрупнойтаксономическойветвиследуетотнестипредставителейPseudomonadaceae, численность которых достигает 50% всех выделенных изолятовбактерий.
Среди характерных видов Pseudomonas следует отметить P. poae.Сравнение таксономического состава природных популяций гетеротрофных бактерий,ассоциированных со сфагновыми мхами, показало общие закономерности численностиразличных группировок бактерий. Так одной из общих тенденций отмечены вариации вчисленности Pseudomonas и Collimonas для разных видов сфагнового мха. ПредставителиPseudomonas составляли наиболее многочисленную группировку эндофитных бактерий S.magellenicum, в то время как для S.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
