Диссертация (1145858), страница 25
Текст из файла (страница 25)
fallax популяция псевдоманад была не стольмногочисленна, более выраженной становится численность Collimonas и Flavobacterium.106Рис 3.6. Компонентный состав бактериального сообщества эндофитных бактерий S. fallax иS. magellanicum, отобранных в Австрийских Альпах (Pürgschachen Moor, Штирия, 2009 г.).Рис 3.7. Компонентный состав бактериального сообщества эндофитных бактерий S. fallax иS. magellanicum, отобранных в Ленинградской области (оз. Волоярви, Всеволожский р-н,2010 г.).Рис 3.8.
Компонентный состав бактериального сообщества эндофитных бактерий S. fallax иS. magellanicum, отобранных у бол. Чистое (Ханты-Мансийский АО, Зап. Сибирь)107Рис 3.9. Видовой состав бактериального сообщества эндофитных бактерий S. fallax и S.magellanicum, отобранных в Ленинградской области (оз. Волоярви, Всеволожский р-н, 2010г.).1083.3.3. Антифунгальные и антибактериальные свойства выделенных изолятовИзучение фунгицидной активности более чем у 400 изолятов бактерий, выделенных изтканей сфагновых мхов, позволило установить, что доля штаммов, способных подавлятьразвитие фитопатогенных грибов, довольно высока и составляет около 60% от общего числабактерий. Кроме того, установлено, что более 30% всех выделенных штаммов в той или инойстепени подавляли развитие ряда важнейших бактериальных фитопатогенов.
Ряд штаммовхарактеризовалсякомплекснойактивностьюкакпротивгрибных,такипротивбактериальных патогенов, некоторые же изоляты имели четко выраженный либобактерицидный либо фунгицидный эффекты (табл. 3.2).В результате работы был отобран ряд штаммов, характеризующихся наиболее выраженнымифунгицидными и бактерицидными свойствами. Так, более подробное изучение фунгициднойактивности этих штаммов позволило установить, что они способны активно подавлять всетест-объекты фитопатогенных грибов различного таксономического положения (различныевиды Fusarium, Alternaria, Pythium) при различных нагрузках фитопатогенного фона (табл.3.3).
Края зон при этом были четко ограничены, хорошо выражены, а размеры зонхарактеризовалисьдлительностьюхранения.Данныештаммыобладалилучшимантибиотическим эффектом.Кроме того, в ходе исследований было отмечено, что бактерицидная активность изучаемыхбактерийпроявляетсяпо-разному.Частьштаммов,напримерAM24AиRF13Hпродуцировали в толщу агара метаболиты, которые полностью подавляли развитиефитопатогена вокруг агарового блока, образуя «чистые» зоны ингибирования. Другиебактерии-антагонисты, отличающиеся быстрым ростом, как например штаммы RM14A,RF14A, активно разрастались вокруг агарового блока, лизируя культуру фитопатогена.
Вобластях непосредственного смешения бактериальных культур происходил активный лизиси гибель клеток фитопатогенных бактерий (рис 3.6).109Таблица 3.2. Пример антагонистической активности бактерий-ассоциантов, выделенных изсфагновых мхов бол. Волоярви (3.10.2009). В таблице приведена процентная доля штаммов,c различной степенью антагонистической активности против фитопатагенов.E.carotovoraP. syringaeP.fluorescensC.michiganensisАктивноеподавление(рост 45%фитопатогенаполностьюингибируется в зоне радиусомболее 10 мм)Умеренноеподавлениеили 15%угнетение роста («чистые» зоныингибирования или угнетениероста в зоне радиусом до 10 мм)Антагонистическая активность 40%отсутствует(развитиефитопатогенавокруглункианалогичноконтролю,культурально-морфологическиесвойства не изменены)Бактерицидная активностьF.sporotrichioidesF.graminearumA.
alternataФунгицидная активностьF. culmorumАктивность подавленияфитопатогена47%42%40%18%10%16%20%15%8%10%16%14%12%22%38%50%50%66%76%72%58%Таблица 3.3. Штаммы эндофитных бактерий сфагновых мхов с наибольшей фунгицидной ибактерицидной активностью.F. culmorumAlternariaalternataE. carotovora var.atroceptica 822P. syringae 8511P.
siringae 213Cl. michiganensissepedonicumpv.6028Бактерицидная активность,радиус зоны подавленияфитопатогена в ммF. sporotrichioides35108P. aspleni RF13HP. poae RF11DP. brenneri RM14BP. fluorescens RF14JP. sp. RM13DCollimonas sp. RF12CS. plymuthica AM24AF. sp.
RM14AF. sp. RF14AФунгицидная активность,радиус зоны подавленияфитопатогена в ммF. graminearumШтамм бактерииантагониста>2515-1715-1610-1518-205-615-200016-17>2010-1210-15>2012-1514-152-30>20>2015-2015-17>2010-15>205-70>20>2015-2015-17>2010-1515-205-1053-410-127-80008-95-67-84-57-86-7001-215-178-1010-125-67-86-70013-1410-129-109-115-612-137-814-159-1010-1211-124-55-6110Рис. 3.6. Лизис клеток P.
syringae pv. tomato бактериями-антагонистами Flavobacterium sp.RM14A: A. – чистая культура P. syringae pv. tomato; B. – чистая культура штамма RM14A; C.– смешанная культура, стрелками показаны не прокрашенные, лизирующиесяиразрушенные клетки фитопатогенных бактерий. Световая микроскопия с простой окраской.1000Х. Масштабная линейка 10 мкм.Таким образом, опираясь на результаты представленной работы, можно отметить высокийантагонистический потенциал бактерий, ассоциированных со сфагновыми мхами, вотношении бактериальных и грибных фитопатогенов.
Показана эффективность антагонизмаисследуемых штаммов бактерий различного таксономического положения в отношенииважнейших бактериальных и грибных фитопатогенов в экспериментах in vitro. Необходимоотметить, что проделанные исследования являются первой частью работы в объяснении ролиэндофитных бактерий, ассоциированных со сфагновыми мхами, в формировании уникальнойантимикробной природы самих растений сфагнов.3.3.4.
Продукция ауксинов и стимуляция проростков кресс-салатаРядштаммов,характеризующихсяналичиемярковыраженныхфунгицидныхибактерицидных свойств, был отобран для дальнейших исследований. Так, следующимкритерием скрининга штаммов с хозяйственно-ценными свойствами, стала способность кпродукции фитогормонов и стимуляции роста сельскохозяйственных культур. Применениеотносительно простого метода, позволяющего оценить способность сразу большогоколичества штаммов к продукции ИУК, и основанного на реакции при взаимодействии среактивом Сальковского, выявило ряд активных изолятов (табл.
3.4). Визуальная оценкарезультатов этой качественной реакции показала, что некоторые штаммы довольно активнопродуцируют ИУК (ее производные) на среде с L-триптофаном, при этом интенсивностьокраски превышала данный показатель контрольного штамма Pseudomonas chlororaphis 228.111Кроме того следует отметить, что из 18 исследуемых штаммов 12 (66%) проявилиположительную качественную реакцию на продукцию ИУК.
Данные штаммы былиотобраны для анализа продукции ауксинов методом высокоэффективной жидкостнойхроматографии (HPLC).Данные о содержании ауксинов в культуральной жидкости исследуемых штаммовпредставлены в таблицах 3.4, 3.5, рис. 3.7, 3.8. Анализируя представленные результатыможно отметить способность к продукции всеми отобранными штаммами трех основныхауксинов: индоли-3-молочной кислоты (ИМК), индолил-3-карбоновой кислоты (ИКК) ииндолил-3-уксусной кислоты (ИУК). Наиболее интенсивно ИУК продуцируется штаммамиP. aspleni RF13H (4,1 мкг/мл), Cryseobacterium sp.
RM12F (5,8 мкг/мл), Serratia plymuthicaAM24A (5,4 мкг/мл), P. sp. RF14D (8,1 мкг/мл), но особенно активным продуцентомауксинов является штамм Burkholderia bryophila AM31A, у которого суммарный уровеньпродукции достиг 41 мкг/мл, а степень конверсии L-триптофана для данного штаммадостигал 69,3%.Сопоставляя полученные данные с данными о продукции ИУК другими штаммами(Кравченко с соавт., 2002), относящимися к группе PGPR, можно отметить более высокийуровень продукции основного фитогормона рядом исследованных в данной работе штаммовбактерий.
Так, штаммы P. chlororaphis SPB1217 и P. fluorescens SPB2137 в аналогичныхусловиях эксперимента накапливали 0,96-1,88 мкг/мл ИУК, в то время как штаммы,описанные в данной работе, имеют в разы превосходящий уровень продукции этогоосновного фитогормона.112Таблица 3.4. Содержание ауксинов в культуральной жидкости исследуемых штаммовбактерий (нг/мл).P. aspleni RF13HB. bryophila AM31ACryseobacterium sp.RM12FS. plymuthica AM24AP. sp.
RF14DP. sp. RM13DP. poae RF11DP. fluorescens RF14JИсследуемый штамм268,9 ±11.61728,7 ±127.957,9 ±3.03,0 ± 0.228,4 ± 1.686,9 ± 5.13145,1 ± 8.6370,4 ±20.72084,4 ±89.64302,1 ±318.411328,4± 577.83285,8 ±177.41222,6 ±69.74653,3 ±274.67879,0 ±464.91722,5 ±96.5Индолил-3уксуснаякислота(ИУК)4105,9 ±176.635100,9± 2597.55821,4 ±296.95430,3 ±293.28167,3 ±465.5125,7 ± 7.440,3 ± 2.462,3 ± 3.5Сумма6459,2 ±277.741131,7± 3043.817207,7± 877.68719,1 ±470.89418,3 ±536.84865,9 ±287.18064,5 ±475.82155,3 ±120.7АуксинИндолил-3молочнаякислота(ИМК)Индолил-3карбоноваякислота(ИКК)113IAAА2250.002000.001750.00EU1500.001250.001000.00ILA500.00ICA750.00250.000.000.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00MinutesБIAA1170.001040.00910.00780.00EU650.00520.00390.00130.00ICAILA260.000.000.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00MinutesРис 3.7.
HPLC-анализ ауксинов в культуральной жидкости штамма Pseudomonas aspleniRF13H при выращивании на среде R2A с L-триптофаном при 28˚C на качалке в течениии 4сут. А. – стандартная смесь ауксинов (в 5 мкл смеси: ИМК –2,5 нг; ИКК – 50 нг; ИУК – 20нг); Б. – культуральная жидкость.ILA – Индолил-3-молочная кислота (ИМК), ICA –Индолил-3-карбоновая кислота (ИКК), IAA – Индолил-3-уксусная кислота (ИУК). EU –интенсивность флуоресценции (единицы эмиссии – Emission Units). Объем анализируемогообразца 5 мкл.114IAAА.1980.001760.001540.00EU1320.001100.00880.00660.00ILA220.00ICA440.000.000.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00MinutesБ.ILA63.0056.0049.0042.00EU35.0021.00IAAICA28.0014.007.000.000.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00MinutesРис 3.8.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
