Диссертация (1145858), страница 20
Текст из файла (страница 20)
По отсутствиюбактериального роста вокруг семян, судили о степени их стерильности.Изучаемые штаммы бактерий культивировали 3-е сут. при температуре 28°С стационарно нажидкой среде R2A (табл. 2.4). Стерильные семена редиса (сорт «Дуро», агрофирма «Домсемян», Санкт-Петербург) замачивали в полученных суспензиях клеток бактерий в течение 30мин, затем в условиях опыта in vitro выкладывали в стерильные влажные камеры наповерхность фильтровальной бумаги. Для каждого варианта на 1 влажную камерувыкладывали по 25 семян в трех повторностях. Семена в контрольном варианте замачивали встерильном физиологическом растворе.
Проростки выращивали в течение пяти суток при28°С. Контрольным штаммом для сравнения ростстимулирующих свойств бактерий выбранштамм Pseudomonas chlororaphis RR228 из коллекции лаборатории технологии микробныхпрепаратов ГНУВНИИСХМ, уже используемый при производстве биопрепаратов.2.5.5. Изучение способности изолятов растворять малорастворимые неорганичесикесоединения фосфораСпособность выделенных изолятов эндофитных бактерий проверяли на модифицированнойсреде Муромцева (табл. 2.7), в которую вносили 2 г/л ортофосфата Ca и фосфоритной муки.82Таблица 2.7. Состав среды Муромцева для изучения фосфатмобилизующей активностибактерий.КомпонентКонцентрация, г/лГлюкоза10,0Аспарагин1,0K2SO40,2MgSO40,2Дрожжевой экстракт0,02Агар15,0pH=7,0Штаммы изучаемых бактерий засевали уколом на поверхность твердой среды Муромцева,посевы инкубировали 5 сут при температуре 28°С.
По диаметру зон просветленияортофосфата Ca и фосфоритной муки судили о способности изучаемых штаммовмобилизовать неорганические соединения фосфора.2.5.6. Изучение ферментативной активностиДля изучения протеазной активности использовали среду с казеином (табл. 2.8). Штаммыизучаемых бактерий засевали уколом на поверхность среды, посевы инкубировали 2-е сут притемпературе 28°С. Для проявления зон растворения казеина чашки после инкубации заливали10 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты.Для изучения амилазной активности использовали среду с крахмалом (табл. 2.9).
Штаммыизучаемых бактерий засевали уколом на поверхность среды, посевы инкубировали 2-е сут притемпературе 28°С. Для проявления зон растворения крахмала чашки после инкубациизаливали 10 мл разбавленного раствора Люголя.Для изучения липазной активности использовали минеральную среду (табл. 2.10). Средуразливали по чашкам Петри, после застывания на поверхность среды наносили 100 мклстерильного подсолнечного масла и равномерно распределяли шпателем.
Штаммы изучаемыхбактерий засевали уколом на поверхность среды, посевы инкубировали 2-е сут притемпературе28°С.Поизменениюокраскииндикатораотсинегодожелтого,свидетельствующей о гидролизе жиров с образованием жирных кислот, судили о наличиилипазной активности у штаммов бактерий.Для изучения целлюлазной активности использовали модифицированную методику (Kasana etal., 2008). Минеральную среду с добавлением микрокристаллической целлюлозы (табл. 2.11)разливали по чашкам Петри, в центр чашки уколом засевали исследуемый изолят бактерий.83Посевы инкубировали 5 сут.
при 28°С, для выявления зон растворения микрокристаллическойцеллюлозы чашки заливали разбавленным раствором Люголя.Таблица 2.8. Среда с казеином для определения протеазной активности бактерий.КомпонентКонцентрация, г/лКазеин10,0Глюкоза0,5Крахмал0,5K2HPO40,3MgSO40,1Агар15pH=6,0Таблица 2.9. Среда с крахмалом для определения амилазной активности бактерийКомпонентКонцентрация, г/лКрахмал2,0Пептон0,5K2HPO40,3MgSO40,1Агар15pH=6,0Таблица 2.10. Минеральная среда для определения липазной активности бактерий.КомпонентКонцентрация, г/л(NH4)2PO41,5K2HPO41,0MgSO40,3CaCl20,3NaCl0,3Агар20,0Бромтимоловый синий 0,05%10,0pH=7,084Таблица 2.11.
Среда с микрокристаллической целлюлозой для изучения целлюлазнойактивности бактерий.КомпонентКонцентрация, г/лЦеллюлоза2,0NaNO32,0K2HPO41,0MgSO40,5KCl0,5Дрожжевой экстракт0,1Агар17pH=6,02.5.7. Изучение физиолого-биохимических свойствДля определения оптимальных температур роста бактерий, культуры уколом засевали наповерхность агаризованой среды R2A и инкубировали в различных диапазонах температур втечение 48 ч.
Скорость роста оценивали по диаметру выросших бактериальных колоний.Для определения оптимальных значений pH питательной среды, культуры уколом засевали наповерхность агаризованой среды R2A с различными показателями pH (5,0 – 8,0) притемпературе 28°С в течение 48 ч. Скорость роста оценивали по диаметру выросшихбактериальных колоний.Использование различных источников азота изучали на среде (табл. 2.12.) с добавлениемследующих минеральных и органических субстратов: NaNO3, NH4Cl, пептон, дрожжевойэкстракт, казеин, гидролизат казеина, бобовый отвар, кукурузный экстракт, желатин, а такжебезазотную среду.Использование различных источников углерода оценивали на фоновой среде (табл. 2.13.) сдобавлением следующих субстратов: D-глюкоза, L-арабиноза, глицерин, дульцитол, Dксилоза, лактоза, D-маннитол, сахароза, D-сорбит, мальтоза, инозит. Готовили 10% растворысубстратов, стерилизовали при 0,5 атм., добавляли в фоновую среду. Конечная концентрациясубстрата – 1%.85Таблица 2.12.Состав питательной среды для оценки использования источников азота.КомпонентКонцентрация, г/лГлюкоза20,0K2HPO41,0KH2PO41,0MgSO40,5NaCl0,5Агар15,0РаствормикроэлементовФедоровупо1,0Таблица 2.13.
Состав фоновой питательной среды для оценки использования источниковуглерода.2.6.ИзучениеКомпонентКонцентрация, г/лПептон5,0K2HPO41,0Бромтимоловый синий 1,6%2,0inколонизационногоplantaпотенциала,биоконтрольной,ростстимулирующей и целлюлолитической активности перспективных штаммов2.6.1. Определение колонизационной активности с помощью метода гнотобиотическихсистемДля выявления способности исследуемых штаммов эндофитных бактерий мхов к активнойколонизации высших растений использовали метод инокуляции семян и последующеевыращивание растений в стерильных условиях гнотобиотических систем (Simons et al., 1996).Контрольным штаммом для сравнения колонизационных свойств бактерий выбран штаммPseudomonas chlororaphis RR228 из коллекции лаборатории технологии микробныхпрепаратовГНУВНИИСХМ,Растительнымиобъектамиужедляиспользуемыйизучения служилиприпроизводствебиопрепаратов.следующие сельскохозяйственныекультуры: пшеница Triticum aestivum (сорт «Веда», селекции Краснодарского НИИ сельскогохозяйства), томаты Solanum lycopersicum (сорт «Персей», агрофирма «Дом семян», СанктПетербург) и редис Raphanus sativus L.
var. radicula (сорт «Дуро», агрофирма «Дом семян»,Санкт-Петербург).Семена пшеницы стерилизовали сначала 2 мин в 70% этаноле, затем промывали в стерильнойводе, после чего двукратно выдерживали в 30% растворе гипохлорита Na в течение 30 мин.86Семена томатов сначала 1 мин отмывали в 70% этаноле, затем двукратно выдерживали в 30%растворе гипохлорита Na в течение 8 мин. После стерилизации семена тщательно отмывали встерильной воде.Далее семена инокулировали бактериальными суспензиями клеток с титром 107 КОЕ/мл ивыращивали в условиях гнотобиотических систем согласно методикам, разработанным воВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (Румянцева с соавт., 2011). Для определенияколичества интродуцируемых бактерий в ризоплане, отмытые корни суспендировали вфизиологическом растворе и учитывали численность микроорганизмов высевом на твердуюсреду R2A.2.6.2.Визуализацияинтродуцируемыхштаммовбактерийспомощьюметодафлуоресцентной in situ гибридизации (FISH)Для изучения пространственной локализации бактерий на корнях растений томатовприменяли метод флуоресцентной in situ гибридизации и люминесцентной микроскопии.
Дляэтого, отмытые от песка корешки томатов подготавливали по методике, описанной выше.Гибридизацию проводили с использованием универсальной бактериальной пробы EUB338(Amann et. al., 1990) . Препараты анализировали с помощью эпилюминесцентного микроскопа(Carl Zeiss, Германия).2.6.3. Детекция интродуцируемых штаммов бактерий методом полимеразной цепнойреакции (ПЦР)Полученные нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК перспективныхштаммов были выровнены со схожими последовательностями, полученными с помощьюпрограммы BLAST GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) других распространенныхблизкородственных видов.
В данных последовательностях определили уникальные участки, ккоторымподобралиспецифические(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/).праймерыПараметрыприпомощиПЦР-реакцииспрограммыPrimer3использованиемданныхпраймеров оптимизировали с использованием тотальной ДНК изучаемых штаммов (п. 2.3.2.).Растения томатов инокулировали бактериальными культурами перспективных штаммов, затемвыращивали в нестерильных условиях закрытого грунта (см. ниже п. 2.5.5). По истечениюпериода вегетации извлекали растения из сосудов, несколько раз отмывали корни встерильной водопроводной воде.
Затем отмытые корни с частицами ризосферной почвытщательно перетерали в физрастворе с использованием ступки и пестика. В качестве контроляиспользовали корни неинокулированых растений и образец почвы. Бактериальую ДНК из87полученных суспензий выделяли согласно протоколу (п. 2.3.2). Состав ПЦР-смеси,использовавшейся при анализе, приведен в табл. 2.8. ПЦР-реакцию с образцами ДНКпроводили при следующих параметрах:1.
Начальная денатурация ДНК - 95°С, 3 мин.2. Амплификация в течение 30 циклов:а). Денатурация ДНК - 95°С, 30 сек.б). Отжиг праймеров - 57°С, 15 сек.в). Синтез ДНК - 72°С, 30 сек.3. Окончание синтеза - 72°С, 5 мин.Результаты ПЦР оценивали электрофоретически в 1% агарозном геле на основе 0,5% буфераТАЕ (табл. 2.7).2.6.4. Изучение биоконтрольной активности штаммов in plantaВ эксперименте по биоконтролю in planta использовали модельные растительно-микробныесистемы.
Бактериальные культуры перспективных штаммов-антагонистов наращивали 72 часав стационарной культуре на жидкой среде R2A (Табл. 2.6).Культуру фитопатогена F. culmorum выращивали 10 суток на картофельно-декстрозном агаредо получения конидий, затем готовили суспензию конидий в стерильном физиологическомрастворе, численность конидий в суспензии определяли прямым подсчетом в камере Горяева.Из полученной суспензии готовили фоновую суспензию с титром конидий 10 4 КОЕ/мл.Семена пшеницы Triticum aestivum (сорт «Подарок Дону») поверхностно стерилизовалисначала 2 мин в 70% этаноле, затем 2 раза по 10 мин в 30% растворе гипохлорида Na ипятикратно отмывали в стерильной воде.
Семена инокулировали 30 мин в суспензии клетоктестируемых штаммов-антагонистов с титром 107 КОЕ/мл и высаживали в вегетационныесосуды объемом 1 л с отмытым кварцевым песком на глубину 1 см. В сосуды с высаженнымисеменами вносили фитопатогенный фон в объеме 100 мл. Повторность опыта – шестикратная.Растения культивировали 7 дней в фитотроне, после чего извлекали из песка, отмывали;отмечали число растений, пораженных корневой гнилью, максимальную длину побегов икорней растения.В эксперименте по биоконтролю черной пятнистости томатов, вызванной Pseudomonassyringae pv.
tomato, культуру фитопатогена выращивали 2 сут на поверхности 2% голодногокартофельного агара. Готовили суспензию бактерий в физиологическом растворе, численностьбактерий в суспензии определяли высевом на плотные питательные среды. Численность P.syringae pv. tomato в фоновой суспензии приводилась к 107 КОЕ/мл. Семена томатов Solanumlycopersicum (сорт «Персей», агрофирма «Дом семян», Санкт-Петербург) поверхностно88стерилизовали 2 мин в 70% этаноле и пятикратно отмывали в стерильной воде. Семенаинокулировали 30 мин в суспензии клеток тестируемых штаммов-антагонистов с титром 107КОЕ/мл и высаживали в вегетационные сосуды объемом 1 л с отмытым кварцевым песком наглубину 1 см. В сосуды с высаженными семенами вносили фитопатогенный фон в объеме 100мл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
