Диссертация (1145858), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Использовали Taq-полимеразу производствакомпании Хеликон (Россия) при следующих соотношениях реагентов (табл. 2.8.).Таблица 2.8. Состав смеси для реакции ПЦР.Объем реакционной смеси20 мклРеакционный буфер (таблица 2.9)1ХДезоксирибонуклеотиды25 mM каждыйПрямой праймер5 pMОбратный праймер5 pMTaq- полимераза1 ед.ДНКДо 5 нгH2O бидист.До 20 мклТаблица 2.9. Состав реакционного буфера для PCR (1X).КомпонентКонцентрацияTRIS-HCl (pH=8,8)67 mM(NH4)2SO417 mMMgCl22,5 mMTween 200,01%H2O бидист.Для проведения ПЦР создавались следующие условия реакции:1. Начальная денатурация ДНК - 95°С, 3 мин.2.
Амплификация в течение 30 циклов:а). Денатурация ДНК - 95°С, 30 сек.76б). Отжиг праймеров - 55°С, 30 сек.в). Синтез ДНК - 72°С, 90 сек.3. Окончание синтеза - 72°С, 5 мин.Результаты ПЦР оценивали электрофоретически в 1% агарозном геле на основе 0,5% буфераТАЕ (табл. 2.7).2.4.3. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена 16-S рРНКДля проведения рестрикционного анализа использовали рестриктазы MSPI и HAEIII(производства компании Fermentas, США).
Рестрикционная смесь имела следующий состав(табл. 2.10).Таблица 2.10. Состав реакционной смеси для рестриктаз MSPI и HAEIII.КомпонентРестриктазаMSPIHAEIIIРеакционный буфер (10Х)2 мкл2 мклРестриктаза2 мкл1 мклПЦР-продукт10 мкл10 мклH2O деионизир.6 мкл7 мклРеакционную смесь инкубировали 16 ч при 37°С, результаты рестрикции оценивалиэлектрофоретически в 3% агарозном геле на основе 0,5% буфера ТАЕ (табл. 2.7).Полученные рестрикционные профили анализировали с помощью программного обеспеченияTotalLab (Nonlinear Dynamics Ltd., США).2.4.4.
Секвенированиефрагментовгена16-SрРНКиопределениевидовойпринадлежности изучаемых изолятов бактерийДля секвенирования фрагментов ДНК были использованы олигонуклеотидные праймеры,применявшиеся на этапе амплификации. Очистку фрагментов и их выделение из агарозногогеля проводили по следующему протоколу:1.
Участокгеля,содержащийнеобходимыйфрагментДНК,помещаливмикроцентрифужную пробирку с 300 мкл раствора А (табл. 2.11). Выдерживали при 65С до полного растворения агарозы, периодически встряхивая.772. Добавляли хорошо перемешанный раствор В (Раствор А с добавлением 40 мг/мл SiO2)в количестве 50 мкл на пробу. Перемешивали 15 мин.3. Центрифугировали 1 мин.
при 2500 об/мин. Тщательно отбирали супернатант.4. Добавляли 100 мкл раствора C (табл. 2.12). Перемешивали.5. Центрифугировали 1 мин. при 2500 об/мин. Удаляли супернатант.6. Добавляли 100 мкл 70% этанола. Перемешивали.7. Центрифугировали 1 мин. при 2500 об/мин. Удаляли супернатант.8. Отбирали остатки этанола, высушивали на воздухе (5 минут).9. Добавляли 20 мкл 10 mM Tris-HCl (pH=8.0).10. Центрифугировали 1 мин., чтобы осадить сорбент.Таблица 2.11. Состав раствора A.КомпонентКонцентрацияГуанидин-(изо)тиоцианат3MEDTA20 mMTRIS-HCl (pH=7,0)10 mMTriton X-10040 мг/млH2O бидист.Таблица 2.12. Состав раствора С.КомпонентКонцентрацияЭтанол25% (v/v)Изопропанол25% (v/v)NaCl100 mMTRIS-HCl (pH=8,0)10 mMH2O бидист.Очищенные фрагменты ДНК использовали для секвенирования. Секвенирование проводилисогласно протоколу фирмы Beckman Coulter (США) для 8-и канального секвенатора SEQ8000с использованием коммерческого набора «SEQ Dye Terminator Cycle Sequencing (DTCS) withQuick Start Kit».
Видовую принадлежность изолятов определяли с использованием программ78BLASTGenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)иRibosomalDatabaseProject(http://rdp.cme.msu.edu/).2.5. Изучение культурально-морфологических, хозяйственно-ценных и физиологобиохимических свойств выделенных изолятов эндофитных бактерий2.5.1. Изучение культурально-морфологических свойствОписывали следующие культуральные свойства выделенных изолятов бактерий при росте наагаризованой среде R2A: цвет и форму колоний, размер, консистенцию, профиль, крайколоний.Морфологические свойства бактерий описывали после микроскопирования фиксированныхпрепаратов, окрашенных по Граму согласно протоколу:1.
На обезжиренное предметное стекло в каплю физраствора бактериологической петлейвносили 18-и часовую культуру бактерий и растирали до размеров монеты.2. Подсушивали на воздухе.3. Препарат фиксировали, проведя трехкратно над пламенем горелки.4. Окрашивали раствором метилового фиолетового в течение 30 сек.5. Сливали метиловый фиолетовый, промакивали препарат фильтровальной бумагой.6. Протравливали препарат раствором Люголя 30 сек.7. Сливали раствор Люголя, промакивали препарат фильтровальной бумагой.8. Обесцвечивали 96% этанолом 15 сек.9. Тщательно промывали стерильной водопроводной водой10. Дополнительно окрашивали водным раствором фуксина основного 30 сек.11.
Тщательно промывали стерильной водопроводной водой, сушили фильтровальнойбумагой.12. Микроскопировали препарат с использованием иммерсионного масла на микроскопе«Микмед-6» («ЛОМО», Россия) с ситемой визуализации изображения.При микроскопировании отмечели окраску бактерий по Граму, форму и размеры клеток,наличие и расположение спор, капсул, чехлов и др. признаки.2.5.2. Изучение фунгицидной активностиТест-культурами при изучении фунгицидных свойств выделенных изолятов послужилиштаммы фитопатогенных и токсигенных грибов: Fusarium graminearum, Fusarium culmorum,Fusarium sporotrichioides (штаммы из коллекции ВИЗР, предоставлены к.б.н.
Т. Ю.79Гагкаевой), Alternaria alternata, Pythium ultimum (из коллекции ГНУ ВНИИСХМ) . Культурыбактерий-антагонистов наращивали на жидкой среде R2A стационарно при 20°С в течение 3-хсуток, фунгицидную активность определяли с помощью метода «колодцев» (Magnusson иSchnurer, 2001) на картофельно-декстрозном агаре (Difco, США). Для этого поверхностнымсмывом с колонии гриба готовили суспензию спор с титром 105 КОЕ/мл. 20 мкл полученнойсуспензии вносили в расплавленный и охлажденный до 45°С картофельно-декстрозный агаробъемом 200 мл. Питательную среду разливали по чашкам, после застывания средыстерильным пробочным сверлом в ней делали отверстия.
В полученные «колодцы» вносилипо 100 мкл культуры бактерий-антагонистов. Посевы инкубировали 5 суток при 25°С, послеинкубации фунгицидную активность оценивали по диаметру зон ингибирования фитопатогенавокруг «колодца».2.5.3. Изучение бактерицидной активностиБактерицидную активность проверяли на 4-х штаммах фитопатогенных бактерий: Erwiniacarotovora var. atroseptica 822, Pseudomonas fluorescens 213, Pseudomonas syringae 8511,Clavibacter michiganensis pv. sepedonicum 6028 (штаммы из коллекции ВИЗР, предоставленык.б.н. А. М.
Лазаревым) с помощью метода «агаровых блоков» (Зенова с соавт., 2002) на 2%картофельном агаре (20 г очищенного картофеля отваривали 30 мин, фильтровали черезмарлю, к фильтрату добавляли 15 г агара, объем доводили до 1 л, устанавливали pH=7,0,разливали по бутылкам, стерилизовали 20 мин при 1 атм.).Культуры бактерий-антагонистов выращивали газоном трое сут. при температуре 28°С. Тесткультуры фитопатогенных бактерий засевали газоном на поверхность картофельного агара,затем на поверхность выкладывались агаровые блоки, вырезанные из культур штаммовантагонистов.
Посевы инкубировали 48 ч при температуре 28°С, бактерицидную активностьоценивали по диаметру зон ингибирования фитопатогена вокруг агарового блока.2.5.4. Изучение способности изолятов к продукции ИУК и ее производных на среде с LтриптофаномИсследуемые изоляты бактерий культивировали 5 суток стационарно при температуре 28°С нажидкой среде R2A с добавлением 2 mM L-триптофана. Затем 1 мл культуры вносили вмикроцентрифужные пробирки и центрифугировали 2 мин на 14000 об/мин. 0,5 млсупернатанта вносили в чистые пробирки, затем добавляли 0,5 мл реактива Сальковского(Salkowski, 1885; Gordon и Weber, 1951). Пробирки инкубировали 10 мин при комнатнойтемпературе, по интенсивности изменения окраски жидкости от бледно-розового до80насыщено-малинового судили об уровне продукции ИУК и ее производных исследуемымиизолятами бактерий.Для выделения ауксинов культуральные жидкости (объемом 1 мл) подкисляли 0,4 н солянойкислотой до рН=3,0 и экстрагировали дважды эквивалентными объемами этилацетата.Полученные экстракты выпаривали досуха при 35°C на вакуумном роторном испарителе ирастворяли в 0.5 мл 18% ацетонитрила.
Полученные образцы фильтровали через нейлоновыемембранные фильтры (Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters) с диаметром пор 0.22 мкм(Sigma,США)иразводилив10раз18%ацетонитриломдляпоследующегопроводилипомощьюхроматографического анализа.Анализауксиноввполученныхэкстрактахссистемыультрапроизводительной жидкостной хроматографии (УПЖХ, UPLC) Waters ACQUITY UPLCH-class с флуоресцентным детектором.Ауксины разделяли на колонке с обращенной фазой Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18(Waters, США), используя изократическое разделение в элюенте ацетонитрил : вода : уксуснаякислота (18:82:0.1 об/об/об) в течение 4 мин, с дальнейшей промывкой колонки элюентомацетонитрил : вода : уксусная кислота (80:20:0.1 об/об/об) в течение 3 мин.
Скорость подачиэлюента составляла 0.3 мл/мин, температура колонки 300С, длины волн флуоресцентногодетектора: 280 нм возбуждающая (Ex) и 350 нм эмиссионная (Em).Идентификацию ауксинов проводили сравнением времен удержания соответствующихвеществ (Sigma-Aldrich, США) в пробах и в стандартной смеси. Количества ауксиновопределяли сравнением площадей пиков в пробах и стандартной смеси с концентрациейкислот 0,5 мкг/мл (индолил-3-молочная), 10 мкг/мл (индолил-3-карбоновая) и 4 мкг/мл(индолил-3-уксусная). Степень использования L-триптофана (%) определяли как долю егомолекул,идущихнабиосинтезэквивалентногоколичествамолекулауксинов,идентифицированных в пробах.Для определения содержания L-триптофана в питательных средах использовали стерильныесреды без дополнительной пробоподготовки.
Анализ L-триптофана проводили на колонке собращенной фазой Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 (Waters, США) 5 минут влинейном градиенте элюента ацетонитрил : вода : уксусная кислота от 1% : 99% : 0,1% до 18%: 82% : 0,1%, с последующей 3-х минутной изократической элюцией и 3-х минутнойпромывки колонки при концентрации компонентов буфера 80% : 20% : 0.1% . Скоростьподачиэлюентасоставляла0.3мл/мин, температураколонки300С,длиныволнфлуоресцентного детектора: 280 нм возбуждающая (Ex) и 350 нм эмиссионная (Em).Идентификацию L-триптофана проводили сравнением его времени удержания в пробах и врастворе химически чистого вещества (Sigma, США). Количество L-триптофана определялисравнением площадей пиков в пробах и стандартной смеси с концентрацией 0,01 мг/мл.812.5.4.
Изучение ростстимулирующей активности на проростках редисаПредварительнобылоптимизированпротоколповерхностнойстерилизациисемян,позволяющий полностью подавить всю эпифитную микрофлору семян, но сохранить вжизнеспособном состоянии зародыш семени:1. Семена выдерживали 2 мин в 70% этаноле2. Отмывали в стерильной водопроводной воде.3. 2-х кратно отмывали в 30% растворе гипохлорита Na в течение 5 мин.4. 5-и кратно отмывали в стерильной водопровоной воде.Для контроля качества поверхностной стерилизации 20 семян выкладывали на поверхностьпитательного агара и инкубировали 48 ч при температуре 28°С.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
