Диссертация (1145858), страница 16
Текст из файла (страница 16)
При этом существуют две основные проблемы, ограничивающие нашепонимание в этой области, - это огромное разнообразие микроорганизмов, присутствующихна деградируемых субстратах и невозможность выделения их в чистые культуры (Wilson,2011).Поскольку бактериальные и грибные клетки не способны поглощать частицы субстрата, онивынуждены выделять целлюлазы во внешнюю среду, кроме того некоторые бактерииобразуют целлюлосомы, которые прикреплены к внешней стороне клеточной стенкибактерий.
Поскольку клеточные стенки растений довольно устойчивы к деградации,некоторые целлюлолитики продуцируют во внешнюю среду до 50% целлюлаз (от общеймассы белка) при росте на целлюлозосодержащих субстратах.1.2.4.1. Микробные целлюлазыНесмотря на разницу в механизмах деградации целлюлозы, все они основаны на продукциицеллюлазмикроорганизмами(Wilson,2008).Целлюлазы–этоферментысамогоразнообразного строения, общим свойством которых является гидролиз целлюлозных волоконпо β-1,4-гликозидным связям. Выделяют 11 различных групп целлюлаз согласно характеру ихаминокислотных последовательностей, согласно же структурного анализа укладки молекулбелка выделяют 8 типов целлюлаз (Wilson, 2011).Такое разнообразие микробных целлюлаз может быть следствием использования широкогоряда природных субстратов, а именно разнообразного строения клеточных стенок растений.Отдельные целлюлазы имеют очень низкую активность на нативной кристаллическойцеллюлозе, однако их каталитическая активность имеет свойство усиливаться со временемполураспада целлюлозы.Целлюлазы отличаются от большинства ферментов тем, что деградируют нерастворимыесубстраты.
Это требует непосредственной диффузии фермента в субстрат, а также смещениясегмента целлюлозной молекулы к своему активному центру, в то время как растворимыесубстраты диффундируют к ферменту и связываются с его активным центром сами по себе.Почтивсеферменты,разлагающиенерастворимыесубстраты,содержатсубстрат-связывающий домен, который обычно соединен с каталитическим доменом и гибкимпептидным линкером (Shoseyov et al., 2006). В случае с целлюлазами, где этот тип доменовбыл обнаружен первым, домен получил название целлюлозо-связывающий, хотя позднее былпереименован в углеводо-связывающий модуль для обозначения других доменов связыванияуглеводов.
Очевидно, что роль углеводо-связывающего модуля заключается в соединениифермента с целлюлозой, при этом каталитический центр тратит меньше времени на62связывание с субстратом и имеет запас времени на перемещение цепи целлюлозы до того какфермент диффундирует от субстрата. До сих пор точно не ясно, способствует ли углеводосвязывающий модуль модификации молекул целлюлозы, либо иным образом содействуеткаталитическому гидролизу целлюлозы (Din et al., 1991).Существуют различные формы целлюлозы, используемые для анализа активности целлюлаз.К примеру – карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), являющаяся растворимой модификациейцеллюлозы и отличным субстратом для эндо целлюлаз, не требующим присутствия углеводсвязывающего модуля.
Аморфная целлюлоза, получаемая при кислотной обработкекристаллической целлюлозы – также хороший субстрат для большинства целлюлаз, нетребующиеприсутствияуглевод-связывающегомодуля.Кристаллическаяцеллюлоза(«Авицель», бактериальная целлюлоза, фильтровальная бумага), присутствующая в клеточныхстенках растений, требует наличия углевод-связывающего домена для эффективногогидролиза (Bhat et al., 1997; Rabinovich et al., 2002).Микробные целлюлазы имеют нелинейный характер кинетики на полимерных субстратах, повидимому, из-за гетерогенности субстратов, однако они подчиняются кинетике МихаэлесаМэнтена в случае слабо-растворимых субстратов (Zhang et al., 1999). Большинство целлюлаз иэндоцелюлаз с открытым активным центром могут связываться и расщеплять молекулыцеллюлозы в любой доступной точке по всей длине цепи (Spezio et al., 1993). Эндоцелюлазыслучайно связываются вдоль молекулы целлюлозы, делая в ней определенное количество«расколов», а затем диссоциируют от субстрата, повышая тем самым вязкость целлюлозы.
Всеэкзоцеллюлазы несут свой активный центр внутри так называемого «тоннеля» и могутсвязываться с молекулами субстрата только на концах цепи, таким образом, они гидролизуютмолекулы поступательно, от одного конца цепи к другому. Таким образом, экзоцеллюлазыимеют низкую активность на КМЦ и не уменьшают ее вязкость. Существует два типаэкзоцеллюлаз, первый «атакует» восстанавливающий конец молекулы целлюлозы, второйсвязывается с невосстанавливающим(Barr et al., 1996). Наконец, открыт третий классцеллюлаз, прогрессивные эндоглюконазы, который был обнаружен только у бактерий.Прогрессивные эндоглюконазы имеют уникальную доменную стуктуру: С-конец несет 9каталитических центров, жестко связанных с углевод-связывающим модулем (Barr et al.,1996).
Эти ферменты проводят начальную «атаку» на цепь целлюлозы, а затемпоследовательно гидролизуют молекулу с невостанавливоющего конца расщепленной цепи.1.2.4.2. Механизмы микробного гидролиза целлюлозыМногие аэробные микроорганизмы используют механизм свободных целлюлаз, по которомуони секретируют набор определенных специфических целлюлаз, большинство из которых63содержат углевод-связывающий модуль, связанный с гибким линкером на одном из концовкаталитического домена. Смесь целлюлаз обычно проявляет синергический эффект накристаллической целлюлозе (Wilson, 2008).
Синергический эффект таких целлюлаз обычноприводит к увеличению активности соответствующих смесей в 15 и более раз по сравнению сактивностью каждой целлюлазы в отдельности (Irwin et al., 1993).Аэробные микроорганизмы производят целлюлосомы – крупные мультиэнзимные комплексы(с многомиллионным молекулярным весом), деградирующие молекулы целлюлозы (Ding etal., 2008). Только несколько ферментов комплекса несут в себе углевод-связывающий домен,но белок, связывающийся с молекулой целлюлозы, и к которому они прикреплены, несодержит такового.
В целом, целлюлазы, продуцируемые аэробными и анаэробнымимикроорганизмами, относятся к схожим семействам; исключение составляют только аэробныегрибы, продуцирующее GH-7 целлюлазы, и целлюлосомы, не несущие в себе 6 семействцеллюлаз. Некоторые анаэробные целлюлолитические термофильные бактерии, такие какCaldicellulosiruptor sp., секретируют многодоменные целлюлазы, содержащие углеводсвязывающие домены. Эти микроорганизмы имеют очень эффективные системы деградациирастительнойклеточнойстенкивотличиеотбольшинствацеллюлолитическихмикроорганизмов (Blumer-Schuette et al., 2010).Некоторые аэробные грибы, способные деградировать целлюлозу, но не лигнин, такие какTrichoderma reesei, являются источником получения коммерческих целлюлаз и используютмеханизм свободных целлюлаз, в то время как патогенные грибы (например бурая гниль)секретируют целлюлазы наряду с пероксидазами (Martinez et.
al., 2005). Пероксид и OHрадикал, образующиеся пероксидазами, облегчают деградацию целлюлозы. Таким образом,патогенныегрибыиспользуютнаборцеллюлаз,способныхдеградироватьнемодифицированную кристаллическую целлюлозу. К примеру, возбудитель бурой гнилиPostia placenta секретирует только одну эндоглюконазу, в то время как большинствосвободноживущих целлюлолитических бактерий производят шесть и более целлюлаз, а такжецеллюлосомы с еще большим набором целлюлаз (Doi, Tamaru, 2001; Wilson, 2004; Martinez etal., 2006).Известны целлюлолитические бактерии Fibrobacter succinogenes, анаэробные доминирующиебактерии рубца, и Cytophaga hutchinsonii, аэробные бактерии почвы, геномы которыхсодержат ряд последовательностей генов эндоцеллюлаз, большинству из которых не хватаетуглевод-связывающих доменов (Xie et al., 2007; Wilson, 2008).
Более того, ни одна из этихцеллюлаз не имела активности на кристаллической целлюлозе. Но оба этих организма связаныс целлюлозой на протяжении всего развития, при этом ни один из них не секретировалсвободные целлюлазы или целлюлосомы. Таким образом, эти микроорганизмы, по-видимому,используют новый, не известный до селе механизм ферментативного гидролизы целлюлозы.64Этот механизм оказался очень эффективен: F. succinogenes развивался на целлюлозныхсубстратах гораздо быстрее, чем большинство целлюлолитических микроорганизмов (Fields etal., 2000). Микроорганизмы, родственные F. succinogenes, довольно широко распространены вприроде, их геномы часто встречаются в метагеномных последовательностях, выделенных изтермитов (Warnecke et al., 2007).
Поскольку все больше и больше бактериальных геномовстановятсярасшифрованными,геныцеллюлазоткрываютсяубольшогочисламикроорганизмов. Saccharophagus degradans имел очень своеобразный набор целлюлаз,большинство из которых принадлежали семейству 5, некоторые семейству 9, и все ониотносились только к эндоцеллюлазам (Weiner et al., 2008). Три целлюлазы из семейства 5, повидимому, являются новым типом прогрессивных эндоглюконаз, у которых процессгидролиза не требует участия вспомогательных доменов, но как именно эти целлюлазыдеградируют субстрат до сих пор остается не ясным (Watson et al., 2009).
Недавно унескольких новых белков была установлена способность к гидролизу целлюлозы.Большинство целлюлолитических грибов содержат многочисленные гены семейства GH-61,некоторые из них кодируют белки, имеющие слабую целлюлолитическую активность (Harriset al., 2010). Семейство белков GH-61 стимулировало гидролиз целлюлозы сырой биомассыTrichoderma reesei в присутствии ионов магния, но данный эффект не обнаруживался начистой целлюлозе.
Thermobifida fusca продуцировал большой объем протеинов двух семействцеллюлаз при росте на целлюлозе (Moser et al., 2008).1.2.4.3. Распространение целлюлолитических микроорганизмов в природе и их роль вдеградации целлюлозыНаиболее изученным местообитанием целлюлолитических микроорганизмов к настоящемувремени является рубец жвачных животных, который по сути является хемостатом,деградирующим растительные компоненты, предварительно измельченные и обработанныеживотным, и в дальнейшем преобразуемые сложным комплексом целлюлолитическихмикроорганизмов. Из 10 млрд.
бактерий в 1 мл содержимого рубца только 10% являютсяцеллюлолитическими, хотя целлюлоза – это основной источник углерода для данногокомплекса микроорганизмов. Отмечено присутствие некоторых целлюлолитических грибов ипростейших в составе микрофлоры рубца, однако бактерии являются основным деструкторомцеллюлозы. Интересно, что в большинстве метагеномных последовательносте, извлеченныхих содержимого пищеварительного тракта муравьев, были обнаружены гены, кодирующиецеллюлазы, близкие целлюлазам рубца жвачных (Suen et. al., 2010).Другимнаиболееизученнымсубстратом,несущимвсебецеллюлолитическиемикроорганизмы, является компост. Начальный этап компостирования происходит при65нормальных температурах и осуществляется при участии бактерий и грибов, затемпроисходит разогрев субстрата и микробное сообщество сменяется представителямитермофильных бактерий (Hansgate et al., 2005; Schloss et al., 2005; Szekely et al., 2009).Деградация целлюлозы происходит в основном в процессе термофильной фазы; при этомсообщества микроорганизмов в составе компоста очень разнообразны и изменчивы, хотясозревшийкомпост, какправило, имеетдовольно просто устроенное сообществоцеллюлолитиков (Szekely et al., 2009).Серьезной проблемой при изучении экологии и физиологии целлюлолитических бактерийявляется их неспособность к культивированию на твердых средах в чистых культурах, а такжеоченьвысокаягетерогенностьихпопуляций.Интересно,чтосоставанаэробныхцеллюлолитических популяций бактерий еще более разнообразен, чем состав аэробныхцеллюлолитиков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
