Диссертация (1145858), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Материалы и методы.2.1. Сбор образцов сфагновых мхов. Определение видовой принадлежности.В представленной работе эндофитные бактерии выделяли из гаметофитов сфагновых мховдвух видов: Sphagnum fallax (H. Klinggr.) H. Klinggr. и S. magellanicum Brid.Образцы сфагновых мхов отбирали в ходе экспедиций на территории трех географическиудаленных регионов: Австрийских Альп, Ленинградской области, Западной Сибири (ХантыМансийский автономный округ). В каждом регионе были выбраны 3 удаленныегеографические точки, находящиеся на расстоянии нескольких десятков километров друг отдруга.
Одна географическая точка представляла из себя не связанную с другими, болотнуюэкосистему, часто имеющаю свое географическое название. Перечень географических точек, вкоторых осуществлялся отбор образцов сфагновых мхов приведен в табл. 3.1.Идентификация видов сфагновых мхов проводилась в полевых условиях по анатомоморфологическим признакам в соответствии с определителем сфагновых мхов (Ignatov et al.,2006). В указанных болотных экосистемах образцы мха каждого вида отбирали в четырехточках, удаленных друг от друга на расстоянии 50-100 м.
При отборе пучок из 50-100растений извлекали из растительного массива, помещали в стерильный пластиковый пакет,который в тот же день в охлажденном виде доставляли в лабораторию для дальнейшихисследований. Для каждой точки отмечали географические координаты, описывали характерокружающей растительности, температуру и pH воды.2.2. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) и конфокальная сканирующая лазернаямикроскопия (CSLM).Растительный материал (гаметофиты растений) отмывали от частиц посторонних включений ирастительных остатков стерильным буфером PBS (табл.
2.1), резали в асептических условияхна секции размером 1,5-2,0 см и фиксировали в течении 18 ч при температуре +4°С сиспользованием раствора А (Табл. 2.2). После этого тщательно удаляли раствор А,растительный материал трехкратно отмывали в охлажденном до +4°С буфере PBS (1 раз – 1мин, второй раз – 5 мин, 3 раз – 10 мин). Для проведения гибридизации растительныйматериал использовали сразу, либо помещали на хранение в растворе B (табл.
2.3) при -20°С.71Таблица 2.1. Состав буфера PBS (Sambrook, Russel, 2001).КомпонентКонцентрацияNaCl137 mMKCl2,7 mMNa2HPO410 mMKH2PO42 mMpH=7,4Таблица 2.2. Состав раствора А для фиксации растительного материала.КомпонентКонцентрация4% раствор пароформальдегида75% (v/v)Буфер PBS25% (v/v)Таблица 2.3. Состав раствора B для хранения растительного материала.КомпонентКонцентрацияЭтиловый спирт 96%75% (v/v)Буфер PBS25% (v/v)Для гибридизации in situ использовали следующие универсальные и групп-специфичныеолигонуклеотидные пробы (производства компании «ДНК-синтез», г. Москва): эквимолярнуюсмесь олигонуклеотидных проб EUB338, EUBII338, EUBIII338 (Amann et. al., 1990; Daims etal., 1999) - универсальную пробу для всех эубактерий, маркированную флуорохромом Cy3;BET42a и GAM42a – специфичные пробы для представителей классов Betaproteobacteria иGammaproteobacteria (Manz et al., 1992), маркированные флуорохромами Cy-5 и 6FAM,соответственно.
Концентрация формамида в гибридизационном буфере составляла 45% дляуниверсальных бактериальных проб и 15% для групп-специфичных проб соответственно. Припостановке отрицательного контроля использовали неспецифичную пробу NONEUB (Amannet. al., 1990).Гибридизация in situ была выполнена согласно протоколу:1. Отмытый от фиксирующего раствора А в буфере PBS растительный материалобрабатывали в течении 10 мин раствором лизоцима (концентрация 1 мг/мл) прикомнатной температуре.2.
Промывали 3 мин в буфере PBS при температуре +4°С3. Обезвоживали образцы этанольной серией с повышающейся концентрацией спирта50% - 70% - 96% по 3 мин каждой серии.724. В микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл помещали образцы растительногоматериала и добавляли по 1 мл гибридизационного буфера С (табл. 2.4).Таблица 2.4.
Состав гибридизационного буфера С.КомпонентКонцентрация (мкл/мл)Для 15% формамидаДля 45% формамида5M NaCl1801801M TRIS-HCl (pH=7,6)20202% SDS55Формамид150450H20 бидист.640340Олигонуклеотидная проба555. Гибридизацию проводили в темноте при температуре 41°С в течении 90 мин.6. Образцы отмывали однократно в подогретом до 42°С промывочном растворе D(таблица 2.5) и выдерживали во второй серии раствора D в течение 15 мин при 42°С.Таблица 2.5. Состав промывочного раствора D.КомпонентКонцентрация (мкл/ 10 мл)Для 15% формамидаДля 45% формамида5M NaCl636601M TRIS-HCl (pH=7,6)2002000,5M EDTA0100H2O бидист.890096407.
Образцы промывали в 1 мл бидист. воды, охлажденной до +4°С.8. Части растений извлекали из микроцентрифужных пробирок, помещали на предметноестекло и под бинокуляром разделяли на отдельные веточки и листья.9. Одиночные листья растений выкладывали на предметное стекло и быстро подсушивалипод струею воздуха.10. Для предотвращения процессов быстрого выгорания флуорохромов препаратыобрабатывали реагентом ProLong Gold Antifade (Invitrogen, Германия).11.
Препраты выдерживали 20 ч при +4°С в темноте и микроскопировали.Кофокальнуюсканирующуюлазернуюмикроскопиювыполнялисиспользованиеммикроскопа Leica TCS SPE (Leica Mycrosystems, Германия). Для детекции олигонуклеотидныхпроб, меченных флyорохромами 6FAM, Cy3 и Cy5, использовали лазеры с длиной волны 488,532 и 635 нм. Флyоресценцию регистрировали в диапазоне 508-566 нм, 665-607 нм и 657-70973нм соответственно. Трехмерную реконструкцию изображений выполняли с использованиемпрограммы Imaris 7.0 (Bitplane, Швейцария).2.3. Выделение бактериальных изолятов эндофитных бактерийДля выделения изолятов эндофитных бактерий использовали следующую методику. Свежиегаметофиты сфагнума в количестве 5-10 штук общей массой 5 г промывали в стерильномфизиологическом растворе для удаления частиц посторонних включений и растительныхостатков. Затем образцы выдерживали 5 мин в 10% растворе перекиси водорода.
Образцытрехкратно отмывали от перекиси в стерильном физиологическом растворе и помещали встерильные керамические ступки. Для контроля качества поверхностной стерилизациифизраствор из последней серии высевали на поверхность питательного агара (ПА). Крастительному материалу добавляли 10 мл стерильного физраствора и перетирали пестикомдополученияоднороднойкашеобразноймассы.Полученнуюмассуметодомпоследовательных серийных разведений высевали на поверхность твердой агаризованийсреды R2A с pH=5,7 (табл. 2.6).Таблица 2.6.
Состав среды R2A.КомпонентКонцентрация, г/лПептон0,5Дрожжевой экстракт0,5Гидролизат казеина0,5Крахмал0,5Глюкоза0,5MgSO40,024K2HPO40,3Пируват Na0,3Агар17H2O дист.1000Посевы инкубировали в течение 5 суток при 20°С, после инкубации подсчитывали общеечисло выросших колоний, бактерии из морфологически различных колоний методомистощающего посева отсевали на новые чашки Петри, проверяли чистоту культур, описываликультурально-морфологические свойства. Для хранения культуры пересевали со скошеннойагаризованной среды R2A, а также замораживали при -80°С в 20% растворе глицерина.Ассоциацию целлюлозолитических бактерий выделяли из образцов сфагновых мхов S.
fallax(H. Klinggr.) H. Klinggr., отобранных в районе оз. Волоярви (Ленинградская обл). Для74изоляции бактерий использовали метод накопительных культур на жидкой минеральной средес добавлением фильтровальной бумаги и показателем pH=5,0. Для этого 3-5 растений мха,предварительно отмытых в стерильном физиологическом растворе, тщательно перетирали васептических условиях с добавлением 10 мл физиологического раствора до получениякашеобразной массы. Затем, по 1 мл полученной растительной массы вносили в колбы с 50 млсреды и складчатым фильтром. Посевы инкубировали стационарно 14 дней при температуре20˚С, периодически встряхивая, отмечали изменения в структуре складчатого фильтра.2.4.
Молекуляроно-генетическая идентификация выделенных изолятов2.4.1. Выделение бактериальной ДНКБактериальную ДНК из чистых культур эндофитных бактерий выделяли согласноследующему протоколу:1. Культуру бактерий наращивали на поверхности твердой среды R2A в течение 24 ч.2. 1-2бактериальныеколониивносиливмикроцентрифужнуюпробиркуиресуспендировали в 500 мкл раствора A. Пробирки инкубировали 10 мин при 37°С.3. В пробирки вносили по 100 мкл 10% раствора SDS и инкубировали 15 мин при 65°С,периодически встряхивая.4. Пробирки полностью замораживали при – 20 °С, затем быстро размораживали.5. Вносили 50 мкл 3 М ацетата Na.6.
Добавляли 500 мкл смеси фенол-хлораформ-изоамиловый спирт (в соотношении25:24:1).7. Интенсивно встряхивали на шейкере в течение 10 мин.8. Центрифугировали 5 мин при 14000 об/мин.9. Отбирали верхнюю водную фазу (супернатант) в чистые пробирки, затем повторноэкстрагировали смесью хлороформ – изоамиловый спирт (в соотношении 24:1).10. Центрифугировали 5 мин при 14000 об/мин.11. Повторно отбирали водную фазу в чистые пробирки.12.
ДНК осаждали равным объемом изопропанола.13. Центрифугировали 5 мин при 14000 об/мин.14. Удаляли супернатант, осадок промывали 70% этанолом, подсушивали при комнатнойтемпературе до полного испарения спирта.15. ДНК растворяли в 50 мкл бидистиллированой воды.16. Отбирали 2 мкл для проверки качества выделеннй ДНК электрофоретически.Электрофорез проводили в 1% агарозном геле на основе 0,5% буфера TAE (табл. 2.7).75Таблица 2.7. Состав буфера ТАЕ (50Х), pH=7,6.КомпонентКонцентрацияTRIS-HCl2MEDTA0,05MCH3COOH~1,56MH2O дист.до 1 л2.4.2. Амплификация фрагментов гена 16-S рРНКДля амплификации фрагментов гена 16-S рРНК использовали праймеры fD1/rD1 (Коростик ссоавт., 2006): прямой (8–27f) - 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’; обратный (1541–1525r) 5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’. Амплификацию фрагментов проводили с использованиемтермоциклера Bio-Rad С1000 (Bio-Rad, США).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
