Диссертация (1145858), страница 28
Текст из файла (страница 28)
Средняя же численность всехинтродуцированных штаммов на корнях томатов в разы превосходила этот показатель накорнях пшеницы.По данным эпилюминесцентной микроскопии, штаммы бактерий Serratia plymuthica AM24A,Flavobacterium saccharophilum RM14A, Pseudomonas brenneri RM14B, Pseudomons poaeRF11D, Collimonas sp. RM14C активно заселяли поверхность корня томатов (рис. 3.9),располагаясь в виде микроколоний или биопленок, направленных вдоль оси корня. Былоотмечено, что характерной особенностью формирования микроколоний является ихлокализация в стыках клеток ризодермы. При этом колонии бактерий были вытянуты вдольпродольной оси корня, залегая довольно глубоко в местах соприкосновения растительныхклеток. Единичные клетки бактерий обнаружены на поверхности корневых волосков, при124этом их количество было значительно меньше, чем непосредственно на поверхностиризодермы.Таблица 3.8.
Приживаемость типовых штаммов эндофитных бактерий сфагновых мхов накорнях пшеницы и томатов.Количество бактерий, КоличествоШтамм105 КОЕ /1 см корня бактерий, 105 КОЕпшеницы/1смкорнятоматовРизосфер КореньаPseudomonas chlororaphis RR228 (контрольный 67,08,219,5штамм из коллекции ВНИИСХМ)Serratia plymuthica AM24A72,010,258,9*Pseudomonas poae RF11D56,04,630,2Flavobacterium sp. RM14A50,28,010,6P. fluorescens RF13H102,0*8,64,3Stenotrophomonas rhizophila RF13C109,3*15,5*123,3*НСР0532,75,620,3Примечание. *Различия достоверны на уровне НСР05Рис 3.9. Локализация изучаемых штаммов бактерий на поверхности корней томатов припомощи флуоресцентной in situ гибридизации и эпилюминесцентной микроскопии. A. –Общий вид корня томатов, микроколонии бактерий Pseudomonas poae RF11D располагаютсявдоль корня.
Масштабная линейка - 50 мкм. Б. - Микроколонии и отдельные клеткиPseudomonas poae RF11D на поверхности корня томатов. Масштабная линейка - 3 мкмИнтересные сведения получены о формировании микроколоний штаммом P. asplenii RF13Hна корнях пшеницы с помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии (рис.3.10). Бактерии локализовались на корнях, формируя структуры двух типов. Часть бактерийформировала тяжи, находящиеся на поверхности корневых волосков и направленные вдольих осей. Основная масса бактерий формировала крупные яйцевидные микроколонии изплотно сгруппированных псевдомонад, которые могли частично распадаться на отдельные125бактериальные клетки.
Такие бактериальные конгломераты локализованы на поверхностикорня и в основании корневых волосков. Необходимо отметить, что подобный типмикроколоний на корнях культурных растений не описан в литературе и, по-видимому,являетсяуникальным.126Рис 3.10. Формирование микроколоний на корнях пшеницы штаммом Pseudomonas asplenii RF13H: А. – Бактериальные клетки формируюттяжи на поверхности корневых волосков, вдоль их продольных осей (1.- поверхность корня; 2.- корневые волоски; 3.-бактериальные клеткина поверхности корневого волоска).
Масштабная линейка – 5 мкм. Б. – Бактериальные клетки объединяются в плотные яйцевидныемикроколонии, расположенные на поверхности корня и у основания корневых волосков (1.- поверхность корня; 2.- корневые волоски; 3.микроколониибактерий).Масштабнаялинейка–20мкм.Конфокальнаясканирующаялазернаямикроскопия.127Для оценки присутствия двух бактериальных штаммов (Pseudomonas asplenii RF13H,Flavobacterium sp.
RM14A ) на корнях томатов в условиях нестерильной почвы использовалиметод ПЦР. Полученные нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНКштаммов были выровнены со схожими последовательностями, полученными с помощьюпрограммы BLAST GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) других распространенныхблизкородственных видов. В данных последовательностях определили уникальные участки, ккоторымподобралиспецифическиепраймерыприпомощипрограммыPrimer3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/).
В итоге для каждого штамма была подобрана парапраймеров, специфичных для участка фрагмента гена 16S рРНК, и оптимизированыпараметры ПЦР-реакции (табл. 3.9).Таким образом, было установлено, что разработанные молекулярные маркеры позволяютдетектироватьизучаемыештаммывризосферекультурныхрастенийвусловияхвегетационных экспериментов с нестерильной почвой (рис. 3.11).Таблица 3.10.
Праймеры, подобранные для ПЦР-детекции изучаемых штаммов в условияхнестерильного вегетационного эксперимента в ризосфере культурных растений.ШтаммПраймеры (прямой и обратный), 5'-3'РазмерTm, ºCПЦРфрагментаPseudomonas asplenii RF13HFlavobacterium sp. RM14ASpecPs-FGTCAACTAGCCGTTGGAAGCSpecPs-RTTAGAGTGCCCACCATTACGSpecFlavo-F CGTAGGCGGTTTAATAAGTCAGTG3335823058SpecFlavo-R CGTGGACTACCAGGGTATCTAATCРис 3.11. Результаты ПЦР-реакций с использованием специфических праймеров для штаммовP. asplenii RF13H (А) и F. sp RM14A (Б): М- маркер молекулярного веса (100-200-300-400…п.н.), 1-3 – положительный контроль - чистая культура бактерий, 4-6 – ризосферная почванеинокулированых растений, 7-9 – ризосферная почва инокулированых растений, 10 –отрицательный контроль- вода.1283.4.2. Ростстимулирующий и биоконтрольный эффекты in plantaРостстимулирующий эффект двух штаммов бактерий Serratia plymuthica AM24A иPseudomonas asplenii RF13H был показан в условиях микровегетационного эксперимента нарастениях редиса Raphanus sativus L.
var. radicula в 2011 году. Обработка семян редисабактериальной суспензией с титром 107 КОЕ/мл оказало положительное влияние на рост иразвитие растений, обеспечив прибавку как средней массы корнеплодов, так и зеленой массы.Так, штамм P. asplenii RF13H обеспечил прибавку средней сырой массы корнеплодов на 25%,штамм S. plymuthica AM24A – на 40% (табл.3.11, рис. 3.12).В 2012 году ростстимулирующий эффект изучался у более широкого круга штаммовразличного таксономического положения.
По результатам микровегетационного экспериментана растениях томатов Solanum lycopersicum выявлен стимулирующий эффект, заключавшийсяв усилении развития общей зеленой массы растений (табл. 3.12). Так, наибольшуюэффективность в данном эксперименте продемонстрировали штаммы Pseudomonas brenneriRM14B, P. asplenii RF13H, P. fluorescens RF14J, обеспечившие прибавку зеленой массы,превосходящую этот показатель для контрольного штамма P. chlororaphis RR228.Таблица 3.11. Стимулирующий эффект, оказываемый изучаемыми штаммами бактерий, нарастения редиса в условиях микровегетационного опыта.ВариантСредняя масса корнеплодов, гСредняя масса зеленойчасти, гКонтроль7,824,6Serratia plymutica AM24A10,9*34,9*Pseudomonas asplenii RF13H9,8*29,0НСР052,06,3Примечание.
*Различия достоверны на уровне НСР05129Рис. 3.12. Стимулирующий эффект, оказываемый изучаемыми штаммами бактерий, нарастения редиса в условиях микровегетационного опыта (А.- Pseudomonas asplenii RF13H, В.Serratia plymutica AM24A, С.- контроль (вода)).Таблица 3.12. Стимулирующий эффект, оказываемый изучаемыми штаммами бактерий, нарастения томатов в условиях микровегетационного опыта.ШтаммКонтроль (без обработки)Pseudomonas chlororaphis RR228 (контрольный штаммиз коллекции ВНИИСХМ)P.
brenneri RM14BP. poae RF11DP. asplenii RF13HP. fluorescens RF14JSerratia plymuthica AM24AFlavobacterium sp. RM14AStenotrophomonas rhizophila RF13CCollimonas sp. RF14СНСР05Примечание. *Различия достоверны на уровне НСР05Стимуляциявусловияхмикровегетационного экспериментаСредний сырой Средний сухой весвесрастения растения томатов,томатов, гг194,120,6310,7*374,2*275,9316,6*321,2*229,7252,1305,9*243,396,024,631,1*23,327,8*29,2*20,721,226,2*23,54,7130В эксперименте по биоконтролю корневой гнили пшеницы, вызванной Fusarium culmorum,было продемонстрировано, что инокуляция семян пшеницы бактериями P.
asplenii RF13Hдостоверно снижает заболеваемость растений с 90 до 40% (табл. 3.13, рис 3.13). Данноезаболевание проявлялось в потемнении участков корней и побурении основания стеблей, атакже разрушением или гибелью корневой системы. При этом было отмечено, что безвнесения патогенного фона F. сulmorumоколо 50% семян уже были пораженывнутрисеменной инфекцией (предположительно вызванной Alternaria sp.), не удаленной припомощи поверхностной стерилизации семян. Данная инфекция проявлялась в почернениизерновки у контрольных растений. Инокуляция исследуемым штаммом P.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
