Диссертация (1145858), страница 30
Текст из файла (страница 30)
Коэффициент заполнения биореактора - 0,5.Определено влияние состава основных производственных сред на численность культурперспективных штаммов-продуцентов. В работе использовали 3 питательные среды: R2A,минеральная среда с мелассой, среда на основе пшеничных отрубей. В таблице 3.15приведены данные о титрах 24-х и 48-и часовых культур перспективных штаммовпродуцентов, выращенных на данных средах.
Было установлено, что оптимальнойпитательной средой, позволяющей получать максимально высокий титр культур наряду снизкой себестоимостью, доступностью компонентов, простотой изготовления является средана основе отрубей.Таблица 3.15. Влияние состава питательных сред на численность культур основныхперспективных штаммов-продуцентов.Численность культуры, млрд.
КОЕ/мл15,0±3,3Flavobacterium sp. RM14A1,3±0,30,98±0,21,4±0,11,5±0,31,0±0,31,5±0,3Serratia plymuthica AM24A10,5±1,05,6±0,611,2±3,011,2±0,14,5±0,512,3±0,2P. brenneri RM14B1,4±0,51,1±0,31,5±0,21,3±0,21,1±0,31,4±0,2основе11,3±1,2Среда наМинеральная12,4±0,2средаСреда R2A15,2±2,0отрубей10,7±1,1основе11,4±1,2Среда наPseudomonas asplenii RF13HсредаМинеральная48 ч культивированияСреда R2A24 ч культивированияотрубейШтамм-продуцентИзучено влияние концентрации кислорода на численность бактерий при культивировании вусловиях биореактора «Торнадо».Показано что разные штаммы с разной скоростью137потребляют кислород из питательной среды.
На рис. 3.18 показана зависимость парциальногодавления кислорода в питательной среде по истечению времени в 24-х часовой культуре. Так,штамм Serratia plymuthica AM14A, Flavobacterium sp. RM14A потребляет кислород сумеренной скоростью, в то время как Pseudomonas brenneri RM14B, P. asplenii RF13Hпрактически мгновенно поглощают весь кислород из среды, что говорит о высоком уровнеаэробного дыхания и соответственно в высоких потребностях данных штаммов в кислороде.Определено влияние различных режимов перемешивания питательной среды на численностьбактерий в 24-и часовой культуре при температуре 28°С. Установлено парциальное давлениекислорода в среде при различной скорости вращения турбины биореактора.
Так, показано, чтопри увеличении скорости вращения турбины в режимах 100-150-200-250 об/мин парциальноедавление кислорода возрастает пропорционально: 20,0-22,0-23,5-24,8 кПА. В таблице 3.16показаны данные о влиянии различной степени аэрации на численность бактерий в 24-ичасовой культуре. Таким образом, установлено что оптимальным и универсальным режимомаэрации является режим, создаваем при скорости вращения 200 об/мин и парциальномдавлении кислорода в среде 23,5 кПа.Установлена зависимость численности бактерий исследуемых штаммов от pH питательнойсреды в условиях 24-х часовой культуры. Данные зависимости численности от pHпредставлены в табл. 3.17.
Показано, что pH питательной среды кардинально не влияет натитр бактериальной культуры, все четыре штамма отличаются широким диапазономоптимальных значений кислотности среды, однако оптимумы роста для всех штаммов лежатв пределах 6,5-7,5.Таким образом, с использованием биореактора «Торнадо» с контролируемыми параметрамикультивирования, были отработан технолологические режимы получения бактериальныхкультур 4-х перспективных штаммов-продуцентов. Для создания лабораторного образцамикробиологическогопрепаратабыл отобранштамм-продуцентP.asplenii RF13H,характеризующийся наличием комплекса полезных свойств. В качестве оптимальной средыдля получения культуры выбрана среда на основе отрубей, режим культивирования составляет48 ч. Основные параметры культивирования: парциальное давление кислорода в среде - 23,5кПа, температура 30˚С, показатель pH=7,0.
Средняя численность получаемой бактериальнойкультуры 15·109 КОЕ/мл.138Рис. 3.19. Снижение парциального давления кислорода в среде 24-и часовых бактериальныхкультур без аэрации.Таблица 3.16. Влияние различных режимов аэрации на численность исследуемых штаммов в24-и часовой культуре.
Численность в млрд. КОЕ/мл.ШтаммУсловия аэрации (об/мин\ парциальное давление, кПа)100\20150\22,0200\23,5250\24,8Pseudomonas asplenii RF13H7,2±3,58,0±2,015,6±3,215,0±3,5P. brenneri RM14B2,8±0,52,9±1,33,3±1,03,1±0,4Flavobacterium sp. RM14A1,0±0,31,3±1,12,1±0,92,0±0,9Serratia plymuthica AM24A9,6±2,210,4±1,511,6±2,110,6±1,6Таблица 3.17. Влияние pH на численность исследуемых штаммов в 24-и часовой культуре.Численность в млрд. КОЕ/мл.ШтаммpH5,566,577,5Pseudomonas asplenii RF13H20±3,521±4,521,6±4,522±2,219,6±3,0P. brenneri RM14B2,8±0,22,9±1,32,9±0,23,2±0,43,3±2,1Flavobacterium sp. RM14A0,6±0,20,64±0,30,6±0,10,52±0,10,7±0,1Serratia plymuthica AM24A9,6±3,59,6±3,410,0±1,510,5±2,011,0±0,11393.5.2.
Создание стабильной формы лабораторного образца микробиологическогопрепарата на основе штамма Pseudomonas asplenii RF13HОсновной проблемой при создании препаративных форм микробиологических удобрений ибиопестицидов на основе грамотрицательных бактерий, в частности бактерий родаPseudomonas, является нестабильность бактериальной культуры по показателю «численностьклеток», а также малая продолжительность хранения. На данном этапе работы осуществленыисследования по повышению стабильности бактериальной культурыP. asplenii RF13H,увеличению еѐ сроков хранения.Кроме того, немаловажным моментом при применении жидких форм биопрепаратов являетсяотсутствие визульной оценки качества нанесения и распределения микробиологическогопрепарата на семена.
Для химических средств защиты эта проблема решена введением всостав композиций ярких красящих веществ (обычно красного цвета), облегчающих контрольза обработкой семенного материала. На данном этапе работы проведено совмещениебактериальной культуры штамма P. asplenii RF13H с красителями для цветовогомаркирования лабораторного образца препарата.Для повышения стабильности лабораторного образца, увеличения сроков его хранения ицветовой маркировки в состав композиции препарата вводились различные консервирующиедобавки, а также стабилизаторы консистенции и красители. Для цветовой маркировкипрототипа биопрепарата применили пищевой краситель «Зеленое яблоко». Краситель неоказал угнетающего влияния на численность и хозяйственно ценные свойства культурыпродуцента биопрепарата. Основным стабилизирующим агентом прототипа биопрепаратавыбрана ксантановая камедь.
Данное вещество выступило в роли загустителя и стабилизатораконсистенции, предотвращающего быстрое оседание бактериальных клеток и равномерное ихраспределение по всему объему культуры. Для предотвращения развития постороннеймикрофлоры и консервации культурыв прототип биопрепарата был добавлен консервантсорбат калия. Состав композиций прототипа биопрепарата на основе штамма P. aspleniiRF13H приведен в таблице 3.19. При приготовлении прототипа биопрепарата концентратбактериальной культуры с титром 15 млрд. КОЕ/мл разбавлялся стерильной водопроводнойводой в соотношении 1:9, к полученной суспензии добавлялись стабилизирующие добавки икраситель. Полученные таким образом композиции закладывались на хранение.В результате был установлен оптимальный состав композиции лабораторного образцамикробиологического препарата на основе штамма-продуцента.
Показано, что концентрацииконсерванта свыше 0,05% оказывают угнетающее влияние на численность бактерий штаммапродуцента, которое заметно уже после 14 сут. хранения. В качестве оптимальной140концентрации загустителя выбрана концентрация 0,25%, обеспечивающая стабильностьконсистенции, но при этом не чрезмерную густоту и вязкость. Таким образом, оптимальнымвыбран состав композиции №5 (табл. 3.19): за 30 суток хранения произошло снижение титраклеток с 1,5 до 1,2 млрд.
КОЕ/мл, в то время как в контроле титр снизился до 0,1 млрд.КОЕ/мл. Через 60 суток хранения численность культуры составила 0,9 млрд. КОЕ/мл, чтоявляется достаточным для эффективного применения биопрепарата. Полученная композиция,благодаря присутствию красителя, обеспечивала цветовую маркировку обработанных семян иоблегчала контроль за нанесением препарата.Таблица 3.19.
Состав композиций лабораторного образца микробиологического препарата длястабилизации численности и сроков хранения.№ п.п.СоставКомпозиция 1Загуститель 0,25%, консервант 0,1%Композиция 2Загуститель 0,1%, краситель 0,5%, консервант 0,01%Композиция 3Загуститель 0,25%, краситель 0,5%, консервант 0,01%Композиция 4Загуститель 0,5%, краситель 0,5%, консервант 0,01%Композиция 5Загуститель 0,25%, краситель 0,5%, консервант 0,05%Композиция 6Загуститель 0,25%, краситель 0,5%, консервант 0,1%Композиция 7Загуститель 0,25%, краситель 0,5%, консервант 0,5%Рис. 3.20. Влияние состава лабораторного образца микробиологического препарата начисленность бактерий P.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
