Диссертация (1145855), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Рисунок 1.).Кроме того, нам впервые удалось обнаружить различия в количестве интерстициальныхлокусов теломерного повтора на ядрышкообразующей хромосоме (Рисунок 5а-в, г6, д1)(Dedukh et al., 2013). После проведения FISH с зондом (TTAGGG)5 мы обнаружили, чтоядрышкообразующая хромосома P. ridibundus содержит 2 интерстициальных локусателомерного повтора, в то время как ядрышкообразующая хромосома P.
lessonae содержит1 интерстициальный локус теломерного повтора (Рисунок 5 а-в).3.2. Хромосомы типа ламповых щеток родительских видовДля того чтобы идентифицировать геномы, передаваемые в ооцитах диплоидных итриплоидных гибридных самок, мы провели детальный анализ хромосом типа ламповыхщеток из ооцитов обоих родительских видов.
Хромосомы типа ламповых щетокпредставляют собой форму мейотических хромосом, встречающихся в растущих ооцитахамфибий на стадии диплотены в профазе первого мейоза. Хромосомы типа ламповых щетокпредставлены полубивалентами, в которых гомологичные хромосомы объединеныхиазмами (Callan, 1986; Gall et al., 2004). Эти хромосомы характеризуются хромомернопетлевойорганизациейисостоятизлатеральныхпетель,соответствующихтранскрипционно активным регионам, и хромомеров, представленных инактивированнымхроматином. Помимо обычных петель, на хромосомах типа ламповых щеток присутствуютпетли сложной морфологии с развитым РНП матриксом (Callan, 1986; Morgan, 2002; Gall etal., 2004).
Эти петли обычно занимают определенные места на хромосомах типа ламповыхщеток и могут служить надежными маркерами для идентификации хромосом (Сallan, 1986;Macgregor et al., 1990; Vishnyakova et al., 2004). В результате морфологического анализапрепаратов хромосом типа ламповых щеток, выделенных из ооцитов 8 самок P. ridibundusи 7 самок P. lessonae мы установили расположение маркерных структур, центромерныхрайонов, локализовали ядрышковый организатор, а также ассоциированные с хромосомамисферы.Для более подробной классификации маркерных структур и идентификациидополнительныхмаркеровмыпровелииммунофлуоресцентноеокрашивание.Использование антител против факторов сплайсинга (К121 и Y12) позволило обнаружитьнакопление мяРНП в некоторых маркерных петлях.
Иммунофлуоресцентное окрашиваниепрепаратов хромосом типа ЛЩ с помощью антител против белков ядрышек No-38,àáABABCDDCEEFFGGHHIKJIKJLLMMPelophylax ridibundusPelophylax lessonaeÓñëîâíûå îáîçíà÷åíèÿ:äëèííûå ìàðêåðíûå ïåòëèãëûá÷àòûå ïåòëèêîèëèí ïîçèòèâíûå ñôåðûãèãàíòñêèå ñëèâàþùèåñÿ ïåòëèÿäðûøêîãðàíóëûêîèëèí ïîçèòèâíûå ãðàíóëûèíòåðñòèöèàëüíûå èòåëîìåðíûåñàéòû ïîâòîðà (TTAGGG)n81Рисунок 6. Цитологические карты хромосом типа ламповых щеток обоихродительских видов комплекса Pelophylax esculentus.Цитологические карты всех хромосом типа ламповых щеток P. ridibundus (а) и P.
lessonae(б). Хромосомы расположены и пронумерованы согласно их относительной длине. Накартах хромосом типа ламповых щеток указано относительное расположение наиболеезаметных маркерных структур, которые окрашены в зависимости от их маркерныхкомпонентов. Маркерные структуры, обозначенные пунктиром, присутствовали не на всехпрепаратах хромосом типа ламповых, но не менее, чем на 70% препаратов. Зеленый цветпоказывает структуры, накапливающие факторы сплайсинга пре-мРНК, красный цвет –коилин-содержащие гранулы, желтый цвет – структуры, обогащенные одновременно ифакторами сплайсинга пре-мРНК, и коилином, синий цвет – ядрышки.82Nopp-140 и фибрилларина позволило нам обнаружить ассоциированные с хромосомойядрышки на хромосоме Н в ооцитах P.
ridibundus. Антитела против белка коилинапозволили показать его накопление в сферических, в теломерных гранулах на концах всеххромосом,атакжевинтерстициальныхрайонаххромосом,соответствующихинтерстициальным сайтам теломерного повтора. FISH на препаратах хромосом типаламповых щеток показала возможность идентификации родительских хромосом спомощью картирования интерстициальных сайтов повтора (TTAGGG)n.Интерстициальные блоки последовательностей (TTAGGG)n могут возникатьвследствие хромосомных перестроек, слияния теломер а также вследствие репарациидвуцепочечных разрывов (Lin, Yan, 2007). Кроме того, последовательности повтора(TTAGGG)n также могут включаться в состав других тандемно повторяющихсяпоследовательностей.
Так как хромосома типа ЛЩ H P. ridibundus и P. lessonae несетсходную локализацию малого (TTAGGG)5 гибридизационного сигнала мы можемпредположить, что интерстициальный сайт повтора (TTAGGG)n возник в этом локусе у ихобщего предка. Другой более длинный блок последовательности (TTAGGG)n на хромосометипа ЛЩ H обнаружен в кариотипе P. ridibundus, что свидетельствует о его возникновениипосле дивергенции P. ridibundus и P.
lessonae.Положение всех маркерных структур, центромерных районов, интерстициальныхсайтов теломерного повтора мы отметили на цитологических картах, впервыесконструированных для всех 13 хромосом типа ламповых щеток обоих родительских видов(Dedukh et al., 2013) (Рисунок 6). На основании полученных карт мы можем заключить, чтородительские виды различаются по составу и расположению маркерных структур нахромосомах типа ламповых щеток (Рисунок 6). Кроме того, различия между родительскимивидами были обнаружены в формировании ассоциированного с хромосомой ядрышка,которое обнаруживается на хромосоме типа ламповой щетке Н только у P. ridubundus, в товремя как у P. lessonae на ортологичной или какой-либо другой хромосоме ядрышкоотсутствует (Рисунок 6).Мы обнаружили не только межвидовые, но также и внутривидовые различия вморфологии некоторых хромосом типа ламповых щеток.
Мы сравнили морфологиюхромосом типа ламповых щеток P. ridibundus и P. lessonae из Харьковской области сморфологией хромосом типа ламповых щеток для обоих родительских видов лягушек изПольши, которые были описаны ранее Буччи и соавторами (Bucci et al., 1990). Мыобнаружили, сходную локализацию сфер, а также формирование некоторых маркерныхпетель на ортологичных хромосомах типа ламповых щеток для разных популяционных83систем. Эти структуры могут также занимать сходное расположение у P.
ridibundus, илиP. lessonae из разных мест ареала, а также у некоторых других видов рода Pelophylax.Однако, мы также обнаружили и межпопуляционные различия не только в расположениинекоторых маркерных структур, но и морфологии центромер на стадии хромосом типаламповых щеток. На хромосомах типа ЛЩ P. ridibundus и P. lessonae из Харьковскойобласти центромеры хорошо идентифицируются как плотные увеличенные хромомеры.
Впротивоположность на хромосомах типа ламповых щеток P. lessonae из Польши,центромеры не различимы на фазово-контрастных микрофотографиях (Bucci et al., 1990).3.3. Анализ хромосомных наборов ооцитов ди- и триплоидных гибридов изразличных популяционных систем бассейна реки Северский ДонецДля того чтобы проанализировать этапы эндорепликации и элиминации геномов воогенезе гибридных животных, мы провели идентификацию кариотипов, передаваемых сооцитами ди- и триплоидных гибридных самок с помощью цитологических карт хромосомтипа ламповых щеток, сконструированных для родительских видов (Dedukh et al., 2015).После анализа кариотипов ооцитов, полученных из гибридных животных, мы обнаружили,что наиболее надежными для идентификации хромосом P.
ridibundus являются хромосомытипа ламповых щеток B, D, E, F, G, H и I, в то время как хромосомы типа ламповых щетокB, C, E, F, G, H и L наиболее надежны для морфологической идентификации хромосомP. lessonae (Рисунок 5 г1-е1`; 6). Другие хромосомы типа ламповых щеток не пригодны дляморфологической идентификации кариотипов родительских видов. Это связано с тем, чтомаркерные структуры на этих хромосомах располагаются в сходных локусах у обоихродительских видов или обладают высоким полиморфизмом.Для упрощения идентификации хромосом типа ламповых щеток из ооцитовгибридов на некоторых препаратах мы провели иммунофлуоресцентное окрашивание сантителами против факторов сплайсинга и коилина, которые являются структурнымикомпонентами для некоторых маркерных структур. Для того чтобы подтвердитьморфологическую идентификацию хромосомных наборов, мы провели FISH с зондом ктеломерному повтору (TTAGGG)n на препаратах хромосом типа ламповых щетокпрактически для всех гибридных самок.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
