Диссертация (1145855), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Мы можемзаключить, что 4 диплоидных самца производили гаплоидные гаметы только с геномомP. ridibundus, один самец производил гаплоидные гаметы с геномом P. lessonae, в то времякак 5 самцов производили часть гамет с гаплоидным геномом P. ridibundus, тогда как другаячасть гамет этих самцов содержала гаплоидный геном P. lessonae (Рисунок 11; 12). Такимобразом, мы предполагаем, что диплоидные самцы производят сперматозоиды с геномомP.
lessonae, который участвует в возникновении большинства диплоидных и триплоидныхлягушек с генотипом LLR.3.5. Анализ гонад головастиков родительских видов и гибридных животныхЧтобы оценить фертильность гибридных головастиков и обнаружить элиминациюгенома, мы проанализировали гонады, диссектированные из головастиков P. ridibundus, атакже ди- и триплоидных гибридных головастиков.В первую очередь мы провели морфологический анализ гонад, диссектированных из15 головастиков P. ridibundus с использованием лазерной сканирующей конфокальноймикроскопии (Рисунок 14). Это позволило сравнить стадии развития головастиков и ихгонад с полученными ранее результатами для представителей зеленых лягушек (Ogielska,Kotusz, 2004).
Пол головастиков P. ridibundus и идентификация стадий развития гонад былиопределены в соответствии с Ogielska, Kotusz, (2004) и Haczkiewicz, Ogielska (2013).Головастики P. ridibundus, у которых возможно определение пола (головастики послестадии развития 29-30 по Госнеру (Gosner, 1960)), были идентифицированы как самки. Мынаблюдали следующие морфологически различимые стадии развития гонад головастиковP. ridibundus: стадия перед половой дифференциацией (стадии развития головастиков 2527 по Gosner, 1960; стадии развития гонад 1-3 по Ogielska, Kotusz, 2004) (Рисунок 14 а),стадия половой дифференциации, связанная с высокой митотической активностью (стадияразвития головастиков 28-34 по Gosner, 1960; стадии развития гонад 4 по Ogielska, Kotusz,2004) (Рисунок 14 б), стадия мейоцитов и ооцитов на стадии диплотены (стадия развитияголовастиков 35-41 по Gosner, 1960; стадии развития гонад 5-9 по Ogielska, Kotusz, 2004).110Рисунок 15.
Модификации хроматина и локализация центромерного повтора RrS1 вядрах зародышевых клеток и микроядрах.Иммуноокрашивание целых гонад с антителами против гиперацетилированного гистонаН4, показало обнаружение этой модификации гистона в хроматине зародышевых клетках,но не микроядер (а1-а3).
В микроядрах диплоидных и триплоидных гибридныхголовастиков, по сравнению с ядрами зародышевых клеток обнаружено накоплениемодификаций гистонов триметилированный по лизину 9 гистона Н3 (б1-б3) идиметилированный по лизину 27 гистона H3 (в1-в3). FISH с зондом к центромерномуповтору RrS1 показала отсутствие центромерных районов P. ridibundus в микроядрах (д).Микроядра отмечены стрелками. Масштабный отрезок = 10 мкм.111Клетки зародышевой линии хорошо различимы, так как обладают более крупнымиразмерами и более слабым окрашиванием хроматина; они обладают большим количествомвнутриядерных телец, в том числе ядрышек (Рисунок 14; 15).Морфологический анализ гонад, диссектированных из 18 диплоидных и 22триплоидных гибридных головастиков, полученных от 4 различных скрещиваний (парыскрещиваний из Рисунков 11; 12: № 3_2013; 3_2014; 6_2014; 14_2014) показал наличиезародышевых клеток в гонадах всех гибридных головастиков (Рисунок 14 в-к; 15).
Дваголовастика обладали меньшим количеством зародышевых клеток по сравнению с другимигибридными головастиками и особями P. ridibundus. У других головастиков количество ираспределение зародышевых клеток было сходно с головастиками P. ridibundus (Рисунок14 а-г). Однако, в гонадах всех гибридных головастиков в отличие от головастиковродительского вида мы обнаружили DAPI-позитивные тельца (микроядра или ядроподобные тельца по Ogielska, 1994) (Рисунок 14; 15). Количество микроядер варьировалоот 1 до 5 на отдельную зародышевую клетку (Рисунок 14 в-з; 15). Большинство микроядеробладали интенсивным окрашиванием DAPI по сравнению с ядрами зародышевых клеток,что может свидетельствовать о более конденсированном состоянии хроматина вмикроядрах (Рисунок 14 в-з; 15). Тем не менее, крупные микроядра характеризуютсяморфологически сходным характером окрашивания DAPI с окрашиванием ядерзародышевых клеток (Рисунок 14 в-з; 15).
Микроядра были обнаружены у 35% клетокзародышевой линии во время развития головастиков на стадии 27-29 по Госнеру (Gosner,1960), у 30% клеток зародышевой линии у головастиков на стадиях развития 30-33 поГоснеру (Gosner, 1960) и у 15% клеток зародышевой линии во время стадий развитияголовастиков 34-36 по Госнеру (Gosner, 1960). Одновременно, в ходе анализа клеточныхделений зародышевых клеток мы не смогли обнаружить отставания хромосом во времяанафазы (Рисунок 14 в, з-к).Для характеристики эпигенетического статуса элиминируемого генома в составемикроядер,обнаруженныхвгонадахгибридныхголовастиков,мыпровелииммуноокрашивание целых гонад с антителами против диметилированного по лизину 9гистона Н3, триметилированного по лизину 9 гистона Н3, диметилированного по лизину 27гистона Н3 и ацетилированного гистона Н4 (Рисунок 15).
В результате иммунокрашиванияс антителами против ацетилированного гистона Н4 интенсивная флуоресценция,соответствующая транскрипционно активному хроматину, была выявлена в ядрах взародышевые клетки, но не в DAPI-позитивных микроядрах, содержащих элиминируемыйхроматин (Рисунок 15 а1-а3). При проведении иммуноокрашивания с антителами против112модификаций гистонов характерных для гетерохроматина (триметилированный по лизину9 гистон Н3, диметилированный по лизину 27 гистон H3) интенсивная флуоресценциянаблюдалась в элиминируемых тельцах и компактных хроматиновых участках винтерфазных ядрах (Рисунок 15 б1-в3).Проведение 3D-FISH на фрагментах гонад, диссектированных из головастиков, сзондом (TTAGGG)n не позволило нам идентифицировать геном на метафазных пластинкахво время клеточных делений зародышевых клеток (из-за большого числа сигналов).
Дляидентификации геномов в гонадах головастиков мы использовали олигонуклеотидный зондк центромерному повтору RrS1, который специфичен к центромерным районам хромосомP. ridibundus, но не P. lessonae. После проведения 3D-FISH с видоспецифичнымолигонуклеотидным зондом к повтору RrS1 мы не обнаружили флуоресцентных сигналовв микроядрах, присутствующих в цитоплазме зародышевых клеток у гибридныхголовастиков (Рисунок 15 г-е). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют отом, что в микроядрах присутствует геном P.
lessonae, но не P. ridibundus.1134. ОбсуждениеИзменения гаметогенеза, связанные элиминацией и эндорепликацией геномов,позволяют гибридным животным формировать фертильные гаметы, что необходимо дляуспешного воспроизводства и возникновения гибридов различной плоидности впопуляционных системах. Изучение процессов элиминации и эндорепликации геномов напримере комплекса среднеевропейских зеленых лягушек позволяет пролить свет нацитогенетические и молекулярные механизмы преодоления репродуктивных барьеров, атакже видообразования посредством межвидовой гибридизации.4.1. Особенности элиминации и эндорепликации геномов в гаметогенезе ди- итриплоидных гибридных самокАнализ кариотипов, передаваемых с ооцитами гибридных лягушек различнойплоидностипоказал,чтобольшинствотриплоидныхгибридовизизучаемойпопуляционной системы характеризуются более регулярным гаметогенезом, по сравнениюс диплоидными гибридами (Рисунок 16).
Диплоидные гибриды обладают более частымиотклонениями в процессах элиминации и эндорепликации геномов родительских видов, чтопозволяет формировать ооциты с различными хромосомными наборами и плоидностью(Рисунок 17). Отклонения от процессов элиминации и эндорепликации приводят кформированию ооцитов с геномной композицией, идентичной двукратной геномнойкомпозиции соматических клеток, что ведет к разнообразию гамет, производимыхгибридными животными (Рисунок 10; 12). Сведения, полученные в ходе анализакомпозиции геномов, передаваемых в ооцитах триплоидных и диплоидных гибридныхлягушек, позволили нам охарактеризовать процессы эндорепликации и элиминациигеномов в оогенезе гибридных животных. Для триплоидных животных цитогенетическийанализхромосомныхнаборовооцитовбылпроведенвпервые.Врезультатецитологического анализа хромосомных наборов ооцитов триплоидных самок P. esculentusс генотипами RRL и некоторых самок с генотипом LLR мы обнаружили, что в гаметогенезепроисходит элиминация генома, представленного одной копией, в то время как два другихгенома формируют ооциты с 13 бивалентами (Рисунок 7а, а` в, в`; 8 а, б; 11).
Таким образом,13 бивалентов, обнаруженные в ооцитах триплоидных гибридных самок, формируютсямежду гомологичными хромосомами, что позволяет им осуществлять рекомбинацию(Рисунок 8 а, б). Полученные данные подтвердили гипотезу, предложенную Гюнтнером исоавторами (Günther et al., 1979), и согласуются сÕRRLLRLÝëèìèíèðóåìûéãåíîìRLÃåíîìíàÿêîìïîçèöèÿ îîöèòàÏðåäïîëàãàåìûåãàìåòûRÃåíîòèïû ãîëîâàñòèêîâRLL115Рисунок 16.
Схема, иллюстрирующая вклад триплоидных гибридных лягушек вподдержание популяционных систем типа R-E.Скрещивания триплоидных гибридных самок с генотипом RRL и диплоидных гибридныхсамцов приводят к возникновению головастиков P. ridibundus и диплоидных головастиковP. esculentus. Триплоидные гибридные самки, как правило, производят гаплоидныеяйцеклетки с геномом P. ridibundus, в то время как диплоидные гибридные самцы могутпроизводить гаплоидные сперматозоиды с геномами P. ridibundus или P. lessonae.116результатами других исследователей (Günther et al., 1979; Günther, 1983; Vinogradov et al.,1991; Christiansen, Reyer, 2009; Pruvost et al., 2013).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
