Диссертация (1145855), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Флуоресцентная и фазово-контрастная микроскопияПрепараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Leica DM4000В, оснащенного объективами 10×/1, 20×/1, 40×/1 и 100×/1, тубусной оптикой с линзами1.0×, 1.25×, 1.6×, монохромной цифровой камерой DFC350 FX, с соответствующимикубиками фильтров для флуорохромов Alexa 488, Cy3 и DAPI (Leica Wetzlar GmbH,Germany). Неокрашенные структуры, которые отличаются от окружающей среды попоказателю преломления, наблюдали, используя фазово-контрастную микроскопию,применяя микроскоп Leica DM4000B. Для получения и обработки цветных изображенийиспользовали программу Leica CW 4000 FISH, а также LAS X CORE.2.11.
Лазерная сканирующая конфокальная микроскопияФрагменты гонад, а также ядра ооцитов для конфокальной микроскопии получали,как описано выше. Изолированные и очищенные от желтка ядра ооцитов инкубировали напротяжении 5 минут в изолирующей среде 5:1, содержащей 0,07 мкМ SYTOX Green(Molecular Probes). Ткани гонад погружали в каплю заключающей среды, содержащейфотопротектор (DABCO, Merck). Образцы анализировали при помощи системы дляконфокальнойлазернойсканирующеймикроскопииLeicaTCSSP5набазеинвертированного микроскопа Leica DMI 6000 CS (Leica-microsystems). Ядра ооцитов игонады головастиков сканировали в XYZ-плоскостях с использованием объектива HC PLAPO 20×, 40×.
Диодный, аргоновый и гелий-неоновый лазеры использовали для74возбуждения флуоресцентного красителя DAPI, красителя SYTOX Green и флуорохромаСу3 соответственно. Изображения совмещали при помощи компьютерной программы LASAF (Leica-Microsystems, Germany).Построение трехмерных реконструкций исследуемых образцов, а также обработку ипостроение максимальных проекций проводили в программе LAS AF (Leica-Microsystems),а также в программе Imaris 5.0.1 (Bitplane, AG). Подсчет количества микроядер а такжефлуоресцентного сигнала в клетках проводили в программе ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/,National Institutes of Health, США).753. Результаты3.1. Характеристика генотипов родительских видов, а также гибридныхпредставителей комплекса среднеевропейских зеленых лягушек различнойплоидностиДля изучения особенностей гаметогенеза и механизмов воспроизводства гибридныхживотных в популяционных системах необходим цитогенетический анализ геномов,передаваемых с гаметами ди- и триплоидных гибридных лягушек.
Идентифицироватьгеном гамет самцов можно с помощью анализа метафазных хромосом и проточной ДНКцитометрии (Боркин и др., 2005; Borkin et al., 2004; Biriuk et al., 2016). Однако определениегеномной композиции гамет гибридных самок представляет более сложную задачу.Методом, который позволяет идентифицировать хромосомный набор растущих ооцитов иопределить видоспецифичные различия в морфологии хромосом, является анализгигантских хромосом типа ламповых щеток, микрохирургически изолированных из ядеррастущих ооцитов (Сallan, 1986; Macgregor et al., 1990; Vishnyakova et al., 2004). Ранее дляхромосом типа ламповых щеток P.
ridibundus и P. lessonae из Польши были обнаруженыморфологические различия, которые позволили исследователям идентифицировать наборыхромосом, передаваемые в ооцитах гибридов (Bucci et al., 1990). Однако полученныеисследователями данные не позволяют идентифицировать каждую хромосому вотдельности и сложны для последующего применения. Кроме того, морфология хромосомтипа ламповых щеток может отличаться у особей родительских видов из разных популяций.Поэтому, для того чтобы обнаружить видоспецифические различия в морфологиихромосом типа ламповых щеток необходим детальный анализ кариотипов растущихооцитов для обоих родительских видов из исследуемой популяционной системы.После отлова представителей комплекса среднеевропейских зеленых лягушек былапроведена их идентификация посредством измерения количества ДНК с помощьюпроточной ДНК-цитометрии. Благодаря различиям между количеством ДНК в геномеP.
ridibundus и P. lessonae можно идентифицировать геномный состав гибридных лягушек(Vinogradov et al., 1990; Borkin et al., 2004). Особи с размером величины С в пределах16.00±0.35 пг были идентифицированы как P. ridibundus, особи с размером величины Cмежду 14.00±0.35 были обозначены как P.
lessonae, особи с показателем величины C впределах 14.90±0.35 были идентифицированы как диплоидные P. esculentus, триплоидныегибридные лягушки с генотипами LLR и RRL имели значение величины C в пределах21.80±0.35 и 22.9±0.35, соответственно (Приложение 2; Таблица 1). Две лягушки обладали76промежуточным значением количества ДНКмежду соответствующими значениямивеличины С для животных с генотипами LLR и RRL (обозначенные как RLX)(Приложение 2; Таблица 1).
Тем не менее, дальнейший анализ хромосомных наборовооцитов, производимых этими животными, позволил нам отнести их к гибридам сгенотипом RRL.В ранних работах показано, что хромосомы родительских видов различаются поинтенсивности окрашивания перицентромерного гетерохроматина в результате Сбэндинга, а также флуоресцентного окрашивания (с использованием красителейАктиномицин D-33 258, Hoechst, DAPI) (Heppich et al., 1982; Bucci et al., 1990; Tunner 1994;Ogielska et al., 2001). Более интенсивный сигнал был обнаружен в перицентромерныхрайонах всех хромосом P.
ridibundus, в то время как в перицентромерных районаххромосом P. lessonae окрашивание практически полностью отсутствовало (Heppich et al.,1982; Bucci et al., 1990; Ogielska et al., 2001). Однако, в некоторых случаях достаточносложно идентифицировать различие в интенсивности флуоресценции на хромосомах P.ridibundus и P. lessonae, в особенности у триплоидных животных. Кроме того, у особейродительских видов из популяционных систем восточной Украины отсутствуют видимыеразличия в интенсивности флуоресценции центромерных районов, что не позволяетидентифицировать митотические хромосомы (Dedukh et al., 2013, 2015).Считается, что интенсивность флуоресценции перицентромерного гетерохроматиназависит от количества перицентромерного повтора, названного RrS1.
С помощью FISH cзондом к последовательности центромерного повтора, амплифицированного с геномнойДНК, было показано его накопление в центромерных районах P. ridibundus и практическиполное его отсутствие в центромерных районах P. lessonae из среднеевропейскихпопуляционных систем (Ragghianti et al., 1995; Marracci, Ragghianti 2008; Marracci et al.,2011). Однако для родительских видов из популяционных систем Восточной Украины FISHс зондом к прицентромерному повтору, амплифицированному с геномной ДНК, не показалдифференциального накопления (Приложение 1. Рисунок 1.) (Dedukh et al., 2013). Тем неменее, нам удалось обнаружить различия в последовательности этого повтора междуособями обоих родительских видов, основанные на результатах работы Мараччи исоавторов (Maracci et al., 2011).
Это позволило подобрать олигонуклеотидный зонд,специфичный для центромерных районов P. ridibundus, но не P. lessonae. В результате FISHс олигонуклеотидным зондом мы обнаружили локализацию сигнала в центромерных78Рисунок 5. Различия между хромосомами P. ridibundus и P. lessonae на примереметафазных хромосом и хромосом типа ламповых щеток.(a-в) Картирование повтора (TTAGGG)n с помощью FISH на метафазных хромосомахP. lessonae (a, a`), P.
ridibundus (б) и диплоидной P. esculentus (в). Один или дваинтерстициальных сайта повтора (TTAGGG)n различимы на ядрышкообразующейхромосоме H (отмечены стрелками). Звездочка обозначает увеличенный фрагмент с двумяядрышкообразующими хромосомами P. lessonae. Стрелки указывают на интерстициальныесайты повтора (TTAGGG)n.(г1-е1`) Хромосомы типа ламповых щеток из ооцитов триплоидных гибридных самок сгенотипом RRL (г1-г6`) и LLR (д1-е1`).
FISH картирование сайтов повтора (TTAGGG)nпозволяет идентифицировать хромосомы типа ламповых щеток H, соответствующиехромосомамтипаламповыхщетокP. ridibundus(г6)илиP. lessonae(д1).Интерстициальные сайты повтора (TTAGGG)n отмечены квадратными скобками. Примерыодних из наиболее хорошо различимых хромосом типа ламповых щеток, которыесоответствуют хромосомам типа ламповых щеток F (г1, г1`), G (г2, г2`), D (г3, г3`), I (г4,г4`), B (г5, г5`) P. ridibundus, а также хромосомам типа ламповых щеток B (д2, д2`), F (д3,д3`), L (е1,е1`) P.
lessonae. Хромосомы на микрофотографиях (г1–г6`) были взяты изполного набора хромосом типа ламповых щеток, представленном на рисунке 2a,a`.Хромосомы на микрофотографиях (д1-д3`) были взяты из полного набора хромосом типаламповых щеток представленного на рисунке 2в, в`.
Различные маркерные структурыобозначены стрелками. Хромосомы окрашены DAPI. Также показаны соответствующиефазово-контрастные изображения (г1`, г2`, г3`, г4`, г5`, г6`, д1`, д2`, д3`, е1`). Головкистрелок указывают на центромеры. Масштабный отрезок = 10 мкм для всехмикрофотографий кроме a`, где масштабный отрезок = 2 мкм.79районах всех хромосом P. ridibundus и полное отсутствие сигнала на хромосомахP. lessonae у особей из изучаемых популяционных систем (Приложение 1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
