Диссертация (1145855), страница 15
Текст из файла (страница 15)
После фиксации (на протяжении 30 минут) в 2% параформальдегиде в 1×растворе фосфатного буфера (PBS - 137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4 • 2 H2O, 2.0мМ KH2PO4; рН 7.4), препараты обезвоживали в серии этанола с повышающейсяконцентрацией (30%, 50%, 70%) и затем хранили в 70%-ном этаноле (на +4°C). Наследующий день отрывали камеры, препараты с хромосомами типа ЛЩ обезвоживали в96%-ном этаноле и высушивали на воздухе. Перед иммуноокрашиванием препаратыхромосом типа ЛЩ не высушивали.
Для последующего анализа под микроскопомпрепараты хромосом заключали в растворе фотопротектора, содержащего 1 мкг/млфлуоресценного красителя DAPI (4',6-диамидин-2-фенилиндол).702.6. Флуоресцентная in situ гибридизацияФлуоресцентную in situ гибридизацию (FISH) проводили на препаратах метафазныххромосом, а также препаратах хромосом типа ЛЩ. В случае FISH на метафазныххромосомах, сперва проводили «состаривание» хромосом посредством нагревания до 60°Св течение 1 часа (в случае свежих препаратов), после чего предобрабатывали РНКазой А(100-200 мг/мл), пепсином (0.01% в 0.01 N HCl) и затем постфиксировали в формальдегиде(1%-ный раствор в PBS, 50 mM MgCl2) в соответствии со стандартными протоколами.Препараты хромосом типа ламповых щеток не предобрабатывали.В качестве олигонуклеотидных зондов использовали (1) конъюгированные сбиотином или флуорохромом Су3 одноцепочечные зонды к теломерному повтору(TTAGGG)5-биотин и (TTAGGG)5-Су3; (2) конъюгированный с флуорохромосом Су3олигонуклеотидныйзондкцентромерномуAAGCCGATTTTAGACAAGATTGC-3`.повторуГибридизационнаясмесьRrS1включалаCy3-5`40%формамид, 2.4 × SSC и 12% декстрансульфат, 20 нг/мкл меченого зонда и тРНК,превышающую количество зонда в 10-50-раз (в случае зонда к повтору RrS1 использовалитакое же количество ДНК спермы лосося).
После нанесения гибридизационной смеси,препараты хромосом типа ламповых щеток и предобработанные препараты метафазныххромосом денатурировали при температуре 81.5 °C на протяжении 5 минут. Гибридизациюпроводили во влажной камере прикомнатной температуре в течение 12-18 часов. Послегибридизации препараты отмывали 3 раза в 2 × SSC при температуре 42°C припокачивании. Биотин детектировали при помощи авидина, конъюгированного сфлуорохромом Cy3 (Jackson Immuno Research Laboratories).
Для усиления сигналапрепараты снова инкубировали с антителами против авидина, конъюгированного сбиотином, и детектировали авидином, конъюгированным с флуорохромом Cy3. Послекаждого этапа проводили отмывки препаратов в трех сменах 4 × SSC по 5 минут при 39°C,обезвоживали препараты в серии спиртов с повышающейся концентрацией (50%, 70%,96%) и высушивали на воздухе. Препараты заключали в растворе фотопротектора,содержащего 1 мг/мл DAPI.ДополнительновкачествезондадляFISHиспользовалиПЦР-продукт,амплифицированный с геномной ДНК c праймерами к центромерному повтору RrS1(Ragghianti et al., 1995)5`-AAGCCGATTTTAGACAAGATTGC-3`;5`-GGCCTTTGGTTACCAAATGC-3`.71Зонды метили биотин-16-dUTP (Roche) с помощью ПЦР.
Меченые зонды растворялидо конечной концентрации 10-50 нг/мкл в гибридизационном буфере (50%-ный формамид,2×SSC, 10% декстран сульфат) с добавлением ДНК спермы лосося в концентрации, котораяв 10-50 превышает концентрацию зонда. Препараты метафазных хромосом денатурировалипри температуре 81.5 °C на протяжении 5 минут. После денатурации препараты хромосоминкубировали во влажной камере при 37°С на протяжении ночи. Затем препаратыхромосом отмывали 3 раза в 0.2× SSC при 60°C, а затем один раз в 2× SSC при 42°C.
Биотиндетектировалиавидином,конъюгированнымсфлуорохромомCy3(JacksonImmunoResearch Laboratories). После FISH все препараты заключали в растворефотопротектора, содержащего 1 мг/мл DAPI.2.7. 3D флуоресцентная in situ гибридизацияДля 3D-FISH мы использовали гонады, диссектированные из головастиков,находящихся на разных стадиях развития. В качестве зондов для гибридизации на целыхгонадах использовали олигонуклеотидные зонды к центромерному повтору RrS1 и ктеломерному повтору (TTAGGG)5, конъюгированные с флуорохромом Cy3.
Диссекциюгонад проводили под наблюдением в стереомикроскопе Leica MZ16. После диссекцииткани фиксировали в 2% растворе формальдегида на 1×PBS в течение 1.5 часов прикомнатной температуре. Затем фрагменты ткани погружали в 1×PBS с добавлением 0.02%азида натрия для долговременного хранения. Перед гибридизацией фрагменты тканипермеабилизировали в 1% растворе Triton X-100 на 1×PBS при комнатной температуре втечение 4-5 часов. После серии из трех отмывок в 1×PBS по 10 минут проводилипредобработку тканей в пепсине (0.01% в 0.01 N HCl) на протяжении 10 минут притемпературе +37°С и постфиксировали 15 мин в формальдегиде (1% раствор в 1×PBS, 50mM MgCl2).
Последующие отмывки проводили в 1×PBS. Перед добавлениемгибридизационной смеси проводили пропитку тканей в 40% формамиде, 12% декстрансульфате, 2× SSC на протяжении 3-4 часов на +37°С при покачивании. После пропиткидобавляли гибридизационную смесь, которая включала 40% формамид, 2.4× SSC и 12%декстрансульфат, 20 нг/мкл зонда и тРНК, превышающую количество зонда в 10-50-раз.Денатурацию проводили при температуре +82°С в течение 15 минут.
Ткани инкубировалис зондом на протяжении 24 часов при покачивании на комнатной температуре. После трехсмен отмывок в 2×SSC на 42°С на протяжении 10 минут, ткани окрашивалифлуоресцентным красителем DAPI (1 мкг/мкл) (Sigma), приготовленном на 1×PBS, на72комнатной температуре в течение ночи и заключали в среду, содержащую фотопротектор(DABCO, Merck).2.8. Иммунофлуоресцентное окрашиваниеДля иммунофлуоресцентного окрашивания в качестве первичных антител мыиспользовали моноклональные антитела (мАТ) мыши и поликлональные антитела (пАТ)кролика в концентрации согласно рекомендациям авторов или производителей: мАТ No185 против No-38 (Schmidt-Zachmann, Franke, 1988), мАТ No114 против белка Nopp-140(Schmidt-Zachmann et al., 1984), мАТ 17с12 против фибрилларина (Pollard, 1997), мАТ 38F3против фибрилларина (Santa Cruz Biotechnology), мАТ K121 против 2,2,7-метилгуанозиновогокэпамяРНК(Krainer,1988),мАТY12противсимметричногодиметиларгинина (Lerner et al., 1981), пАТ H-300 (Santa Cruz Biotechnology) и пАТ R288 ипротив С-концевого домена коилина (Andrade et al., 1991).
Препараты хромосом типаламповых щеток инкубировали в 70%-ном, 50%-ном, 30%-ном этаноле в течение 5 минут вкаждом и затем в 1× PBS, содержащем 0.01% Tween-20. Затем препараты блокировали врастворе 1×PBS, содержащем 1% блокирующего реагента (Roche), на протяжении 1 часа накомнатной температуре. Следующий этап включал инкубацию препаратов с первичнымиантителами, разведенными в блокирующем растворе, в течение 1 часа при комнатнойтемпературе.
После серии из трех отмывок в 1×PBS, содержащем 0.05% Tween-20, по 5минут в каждой проводили инкубацию с вторичными антителами, конъюгированными сфлуорохромами Cy3 или Alexa 488, в течение 1 часа при комнатной температуре. В качествевторичных антител использовали антитела козы против IgG+IgM (H+L) мыши,конъюгированные с флуорохромом Cy3 (Jackson Immuno-Research), и/или антитела козыпротив IgG (H+L) кролика, конъюгированные с флуорохромом Alexa 488. Препаратыотмывали в трех сменах раствора PBS, содержащего 0,05% Tween-20. После отмывокпрепараты обезвоживали в 30%, 50%, 70% и 96% этаноле, высушивали и заключали врастворе фотопротектора, содержащего 1 мкг/мл DAPI.2.9. 3D иммунофлуоресцентное окрашиваниеДля постановки флуоресцентного окрашивания на диссектированных гонадахголовастиков использовали следующие мАТ мыши и пАТ кролика: мАТ ab1220 противH3K9Me2 (Abcam), мАТ ab6002 против H3K27Me3 (Abcam), пАТ ab8580 против H3K4Me3(Abcam), пАТ ab8898 против H3K9Me3 (Abcam), пАТ 06-866 против H4Ac (Up-state).Фиксацию и хранение диссектированных гонад головастиков проводили как описано выше73для3DFISH.Передиммунофлуоресцентнымокрашиваниемфрагментытканипермеабилизировали в 1% растворе Triton X-100 на 1×PBS на комнатной температуре втечение 4-5 часов.
Отмывки проводили в 1×PBS при покачивании на комнатнойтемпературе. Затем ткани погружали на 2-3 часа в 1% блокирующий раствор (Roche),приготовленный на 1×PBS. Инкубацию с первичными антителами, разведенными дорабочей концентрации в блокирующем растворе, проводили при покачивании накомнатной температуре в течение ночи. После трех смен отмывок в 1×PBS с 0.01%Tween(ICN Biomedical Inc) добавляли вторичные антитела, разведенные до рабочей концентрациив блокирующем растворе согласно рекомендациям фирмы изготовителя. После 8-12 часовинкубации на комнатной температуре проводили три смены отмывок в 1×PBS с0.01%Tween (ICN Biomedical Inc). Ткани окрашивали флуоресцентным красителем DAPI (1мкг/мкл) (Sigma), приготовленном на 1×PBS, на комнатной температуре в течение ночи изаключали в среду, содержащую фотопротектор (DABCO, Merck).2.10.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
