Диссертация (1145855), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Деградацияклеточныхделений.Не хромосом.способностьотцовскиххромосом прикрепиться кмикротрубочкамверетенаделенияДлядругихвидовсэлиминациейотцовскогогеномаМорфологическидетектируемая компактизацияэлиминируемого хроматинаНе известноPSRиндуцируемаяэлиминация уHymenopteraWolbachiaиндуцируемаяцитоплазматическаянесовместимость у насекомыхИзбирательн Межвидовыеаягибридыэлиминация пшеницыигеномапросаодногоизродительских видов уПредположительнодеградацияхромосомЭлиминаци Не известноягеномасперматозоидаПредположительнометилирование цитозинаэлиминируемом геномеНарушениеконденсации,в связанное с нарушениемфосфорилирования гистонаН3,нарушение работыконденсинов.МорфологическиНарушениеконденсации,детектируемая компактизация связанное с аберрантнойэлиминируемого геномазагрузкой гистона Н3 и егофосфорилированиемРасположениевэкваториальнойплоскостихроматиновойглыбки в анафазепервогоделениязиготы. ПостепеннаядеградацияЦелыйНе известногеномодного изродительских видовМорфологическиОтставание хромосом или ихдетектируемая компактизация фрагментоввмитозе,элиминируемого геномасвязанное с нарушениемфункционированияцентромеры.Отпочковывание хроматинаиз ядер во время интерфазыФормированиемикроядерспоследующимнакоплениемдвунитевыхразрывовидеградация генома64гибридоврастенийЭлиминация Poeciliopsisгенома приклональномилигемиклональномвоспроизвод BacillusствеумежвидовыхгибридовAmbistomaP.
esculentusЭлиминаци Не известнояцелогогеномаотцовскогопроисхожденияУдалениеодного изродительских геномовцеликомиличастичноУдалениеодного изродительских геномов,нетзависимости от пола.МорфологическиФормирование униполярногодетектируемая компактизация веретена.Неспособностьэлиминируемого геномаэлиминируемогогеномацелого генома прикрепитьсяк веретену деления в митозезародышевых клетокНеспособностьэлиминируемогогеномацелого генома прикрепитьсяк веретену деления в мейозеНе известноПредположительнодеградацияэлиминируемогогенома.Не известноНе известноНе известно.Предположительнопостепенное отставаниехромосом в серии митозов,и/или отпочковывание вовремя интерфазы из ядерзародышевых клеток652.
Материалы и методы2.1. Сбор материалаПредставители комплекса среднеевропейских зеленых лягушек (Pelophylaxesculentus complex) были отловлены в Харьковской и Донецкой областях ВосточнойУкраины (Рисунок 4). Особи и P. lessonae (N=9) были собраны в бассейне реки Днепр,окрестности пгт. Краснокутск. Место отлова P.
lessonae является ближайшим местомобитания P. lessonae к центрам формирования гибридов (Рисунок 4). ПредставителиP. ridibundus (N=14) были отловлены из бассейна реки Днепр, где они не участвуют вформировании гибридов, а также из бассейна реки Северский Донец, где они образуютсовместные популяционные системы с представителями P. esculentus (Рисунок 4).Гибридные лягушки были отловлены из бассейна реки Северский Донец (Харьковской иДонецкой областей). Сбор материала проводился в популяционных системах R-Е типа, гдебыло отловлено 25 триплоидных гибридов с генотипом RRL, 6 триплоидных гибридов сгенотипом LLR, а также 25 диплоидных гибридов (Рисунок 4). Все отловленные гибридныелягушки включали особей обоих полов (Приложение 2, 3, Таблица 1, 2).
Отлов животныхпроводился в 2010-2015 годы. Все манипуляции с животными проводили в соответствии смеждународными нормативами. Для взятия образцов тканей и эвтаназии каждая особь былапогружена в анастезирующий 1 % раствор 3-аминобензойной кислоты этилового эфира(MS222 (Sigma)).2.2. Проточная ДНК цитометрияПроточную ДНК-цитометрию проводили совместно с Ю. М. Розановым иС. Н.
Литвинчуком (Институт цитологии, РАН, г. Санкт-Петербург). Для всех отловленныхлягушек провели измерение количества ДНК в ядрах эритроцитов, с целью идентификацииродительских видов и различных форм гибридов (Vinogradov et al., 1990; Borkin et al., 2004).Проточная цитометрия была проведена с использованием проточного флуориметра,оборудованного дуговой ртутной лампой в качестве источника света, сконструированногов Институте Цитологии, РАН, г.
Санкт- Петербург. Мультиканальный анализатор,соединенный с микрокомпьютером, применяли для получения ДНК-гистограмм. Послеанестезии у животных брали кровь из бедренной вены. Кровь смешивали с 0.1% Triton X100, 20 мкл/мл этидиумом бромида и 15 мMRRRRLLLRLLLR67Рисунок 4. Карта с указанием основных мест отлова представителей комплексазеленых лягушек.На диаграммах изображено относительное количество пойманных лягушек для каждогоместа отлова в Харьковской и Донецкой областях. Особей P.
ridibundus (оранжевый цвет)и P. lessonae (синий цвет) отлавливали из популяций, где отсутствуют гибридные формы.Кроме того, особей P. ridibundus отлавливали из популяционных систем R-E типа, гдеособи родительского вида обитают совместно с диплоидными гибридами (зеленый цвет), атакже триплоидными гибридами с генотипами RRL (желтый цвет) и LLR (фиолетовыйцвет).68MgCl2.
После 4-6 ч инкубирования при температуре +4°C проводили измерения количестваДНК. Для того чтобы оценить размер генома исследуемых животных, данные о содержанииядерной ДНК в их клетках сравнивали со стандартными образцами клеток для P. ridibundusи P. lessonae, а затем дополнительно с образцами клеток домовой мыши (Mus musculus;спленоциты, C57B1 линия, 6.8 пг, по Bianchi et al., 1983). Содержание ядерной ДНКопределяли в результате анализа гистограмм по формуле: 2C содержание ДНК = (значениепика образца) / (относительный стандартный пик) × (относительные стандартные образцыP. ridibundus или P.
lessonae) (Litvinchuk et al., 2004).2.3. Постановка лабораторных скрещиванийПосле идентификации геномной композиции часть исследуемых лягушек былаиспользована для постановки системы скрещиваний. Сформированные пары былирассажены в контейнеры 60 см × 40 см × 30 см. Для стимулирования откладки икры самцови самок инъецировали 400 мл Сурфагона (синтетический аналог лютеинизирующегорилизинг гормона) с концентрацией 5 мкг/мл (Browne, Zippel, 2007). В течение 12-48 часовсамки обычно откладывали икру. Отложенную икру помещали в отдельные емкости,заполненные на 5-7 см водой и аэрируемые с помощью компрессора.
Стадии развитияголовастиков определяли в соответствии с таблицами развития, разработанными Госнером(Gosner, 1960). Начиная со стадии 28 (питающийся головастик) до стадии 40 (началометаморфоза), каждую неделю мы в случайном порядке отлавливали 5-20 головастиков изкаждой кладки для последующего кариотипирования.2.4. Получение препаратов метафазных хромосомПрепараты метафазных хромосом были получены из взрослых животных иголовастиков, образовавшихся в результате искусственных скрещиваний.
Взрослых особейинъецировали 0.2-0.5 мл 0,3% раствором колхицина. Спустя 48 часов до биопсии тканикишечника или 24 часа до биопсии семенников проводили эвтаназию в анестезирующем0.5% растворе MS222 (Sigma), после чего диссектировали необходимые ткани. Дляполучения препаратов метафазных хромосом из тканей головастиков колхицин неиспользовали. Головастиков погружали в 0,15% анестезирующий раствор MS222 (Sigma)после чего диссектировали жабры, кишечник и хвост. Диссектированные ткани взрослыхживотных и головастиков помещали в гипотонический раствор на 25 минут, после чегопогружали в фиксатор 3:1 этанол-ледяная уксусная кислота на 30 минут.
После двух сменфиксатора ткани хранили до приготовления препаратов хромосом при температуре +4°С.69Перед приготовлением препаратов метафазных хромосом ткани переносили в свежуюсмену фиксатора на 5-10 минут. После этого фрагмент ткани погружали в 60% уксуснуюкислоту на 5 минут и размельчали. Полученную суспензию клеток наносили на предметныестекла, нагретые до 60°C, на которых, после испарения фиксатора, оставались хромосомыи клеточные ядра.2.5. Выделение хромосом типа ламповых щетокПрепараты хромосом типа ламповых щеток (ЛЩ) были получены из ооцитовP. ridibundus, P.
lessonae, а также ди- и триплоидных P. esculentus согласно методике,описаной Г. Калланом и соавторами (Callan et al., 1987) с модификациями Д. Голла исоавторов (Gall et al., 1991). Перед диссекцией яичника лягушек погружали в 0.5%анестезирующий раствор MS222 (Sigma). Ооциты исследуемой особи отделяли отфрагментов яичника в растворе OR2 (82.5 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mMCaCl2,1mM Na2HPO4, 5 mM Hepes; pH 7.4).
Ядра микрохирургически изолировали изооцитов с помощью пинцета и вольфрамовых игл в изолирующей среде 5:1 (83 mM KCl, 17mM NaCl, 6.5 mM Na2HPO4, 3.5 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT; pH 7.0-7.2). Ядернуюоболочку удаляли в растворе 5:1, разбавленном в 4 раза H2O, и с добавлением 0.1%параформальдегида и 0.01% 1 M MgCl2 для лучшего расхождения хромосом иприкрепления их к покровному стеклу. Все микрохирургические процедуры проводили поднаблюдением в стереомикроскопе Leica MZ16. После удаления ядерной оболочкисодержимое ядра переносили в специальные лунки, образованные стеклянными камерами,которыебылипредварительнонаклеенынапредметныестекла.Препаратыцентрифугировали на протяжении 30 минут в центрифуге с охлаждением (при +4°C) при4000 об/мин.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
