Диссертация (1145849), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Однако если такое объяснениесоответствует действительности, то можно предположить, что при степеничистоты фракции В-лимфоцитов порядка 95% среди клеток могут оставатьсяТ-лимфоциты, незначительное количество которых, тем не менее, можетповлиять на конечный результат. С другой стороны, при сокультивированиивыделенных с помощью иммунномагнитной сепарации В-лимфоцитов сМСК, в части экспериментов (две из трех культур МСК жировой ткани и однаих трех культур МСК пупочного канатика) наблюдали стимуляциюпролиферации В-лимфоцитов, что также свидетельствует о зависимостихарактера влияния МСК на пролиферации В-лимфоцитов от характеристиккультур МСК.Согласно литературным данным, также характер взаимодействия МСК и ВлимфоцитовможетпредъявляемогозависетьВ-лимфоцитам,отприродыстимулирующегопринадлежностиагента,В-лимфоцитовксубпопуляциям В1а, В1b или В2-клеток и стадии дифференцировки В-клеток(Климович, 2014).Вариабельность действия МСК по отношению к В-лимфоидным клеткам, взависимости от стадии их дифференцировки была показана при использованиив качестве тест-объектов клеток лимфобластоидных (Namalva) и миеломных(U266) линий по изменению уровня продукции иммуноглобулинов в них.Использованная в работе линия Namalva, полученная из коллекции клеточныхкультур ИНЦ РАН является сублинией, которая отличается от других сублинийотносительно высоким содержанием внутриклеточного IgM и низким уровнемсекретируемого IgM (Самойлович и др., 2010).
Судя по этим признакам, эта109сублиния относится к числу тех, которые представляют собой зрелые Bлимфобласты. Клетки линии U266 - соответствуют зрелым плазматическимклеткам. Усиление продукции внутриклеточного IgM в клетках линии Namalva,наблюдали только в присутствии МСК, полученных из жировой ткани ипупочного канатика, но не костного мозга. МСК костного мозга также неизменяли уровень продукции IgE в миеломных клетках U266, в отличие отМСК из других источников (Айзенштадт и др., 2014). Возможно, лимфоидныеклетки,представляющиеразныестадиидифференцировки,могутстимулировать МСК различного тканевого происхождения к выработке разныхцитокинов и ростовых факторов.
Этот аспект взаимодействия МСК и Bлимфоидных клеток остается наименее изученным и требует дальнейшихисследований.Использованиеиспользованиятакойклеточныхотносительнолинийсстандартизованнойпостоянной(засчетпролиферациейиконститутивной продукцией иммуноглобулинов) экспериментальной моделипозволило определить дополнительные параметры, влияющие на проявлениефункциональной активности МСК.
Например, факторы, стимулирующиенакоплениеIgEмиеломнымиклетками,продуцировалитолькопролиферирующие МСК. Представленные результаты могут объяснять рядимеющихся в литературе противоречий, касающихся способности МСК влиятьна продукцию Ig клетками B-лимфоидного ряда. В частности, расхождения воценке действия МСК жировой ткани на содержание Ig в клетках Namalva иU266 с данными, описанными ранее (Самойлович и др., 2013), могут бытьсвязаны с различиями в фазах роста культур МСК, численном соотношенииМСК и лимфоидных клеток, а также в сроках сокультивирования.Исходя из имеющихся литературных данных и наших результатов, можносделатьвыводомультифакториальностипроцессареализациииммуномодулирующего действия МСК на В-лимфоциты.
Это, возможно,является отражением того, что в данном случае влияние МСК может быть какстимулирующим, так и супрессивным, что, в свою очередь необходимо для110реализациигомеостатическихфункцийМСКвотношениииммунокомпетентных клеток.В ходе наших исследований было показано, что МСК костного мозга имеютряд недостатков для клинического применения. Кроме таких негативныхмоментов, как необходимость инвазивной процедуры для получения костногомозга и низкого содержания МСК в нем, наши результаты свидетельствуют осниженной функциональной активности МСК костного мозга, по сравнению склетками из других источников, что может затруднять получение достаточногодля применения количества клеток.
Это является потенциально значимым присистемном введении МСК. Кроме того, эффективность применения МСКкостного мозга может быть снижена за счет меньшей иммуносупрессорнойактивности. Например, пролиферация Т- и В-лимфоцитов не изменяется поддействием МСК костного мозга, если в смешанной культуре они находятся внизкой концентрации.
Это, возможно, также связано со сниженной экспрессиейCD90 и меньшей продукцией IL-10 в МСК костного мозга относительно клетокиз других источников. Параллельно, в использованных экспериментальныхмоделях было показано, что функциональная активность МСК пупочногоканатика относительно лимфоидных клеток сходна с МСК жировой ткани.Кроме различий, обусловленных источником получения культур МСК, быливыявлены индивидуальные особенности функционирования клеток.
МСК,выделенные из биологического материала разных доноров, оказывалиразличное действие на пролиферативную активность В-лимфоцитов – как вприсутствиидругихиммунокомпетентныхклеток,такиприсокультивировании с популяцией В-лимфоцитов, выделенных методомиммуномагнитнойсепарации,взависимостиотсоотношениявзаимодействующих клеточных популяций.Функциональную активность МСК также изучали в экспериментах, вкоторыхмоделировали одно из звеньев эффекторной фазы аллергических111реакций,аименноизменениесостояниякультивируемыхклетоксенсибилизированного организма при повторном контакте с аллергеном.Рецепция аллергена обеспечивается в этом случае специфическимиантителами класса IgE, которые либо встроены в мембраны В-лимфоцитов ввиде В-клеточного IgE-рецептора (Wu et al., 2014), либо фиксированы наповерхности эозинофилов, базофилов или тучных клеток посредствомвысокоаффинного Fc-рецептора (Stone et al., 2010).
В-лимфоциты отвечают насвязывание аллергена продукцией IgE, а клетки гранулоцитарного ряда синтезом IL-4, которыйв свою очередь стимулирует формированиесубпопуляции активированных Т-лимфоцитов.Согласнообщепринятомупредставлению,приразделенииклетокпериферической крови на фиколле лимфоциты и моноциты задерживаются вверхнем слое градиента, а гранулоциты вместе с эритроцитами оказываются внижнейфракции(Nobleetal.,1968).Анализклеточногосоставамононуклеарных фракций, полученных в настоящей работе, показал, что ввыделенных популяциях наряду с лимфоцитами присутствовали моноциты игранулоциты, т. е.
все клеточные типы, которые ответственны за появлениесдвигов, наблюдаемых при культивировании в присутствии аллергенов.Следует отметить, что группа обследованных доноров была достаточнагетерогенной по типу сенсибилизирующего аллергена, формам и тяжестиклинических проявлений атопической гиперчувствительности. Кроме того,отличия касались состава мононуклеарной фракции, в частности процентногосодержания гранулоцитов – одних из ключевых участников эффекторногозвена аллергических реакций. Тем не менее, в целом изменения состоянияклеток мононуклеарной фракции при контакте с аллергенами были достаточнооднородными: во всех случаях наблюдали продукцию IgE и IL-4, вбольшинстве опытов происходил рост численности популяции активированныхТ-клеток.
В трех образцах (№ 6, 7 и 10) реакции лейкоцитов на внесение вкультуру аллергена проявлялись в появлении в культуральной среде IgE и IL-4,но роста численности активированных Т-лимфоцитов в этих пробах не было.112Возможно, в указанных случаях темп дифференцировки был замедлен, инакопления клеток к моменту прекращения культивирования не произошло.Проявления иммуномодулирующей активности МСК, полученных изразных источников, в отношении лейкоцитов доноров-аллергиков оказалисьоднозначными.
В ходе экспериментов было установлено, что аллогенные МСКпредотвращалиувеличениеотносительногосодержанияТ-лимфоцитов,несущих маркер поздней активации HLA-DR. Увеличение экспрессии маркеровактивации лимфоцитов (CD25, CD71, HLA-DR) рассматривают как один изпоказателей обострения атопических заболеваний, причем уровень экспрессииHLA-DR связывают с тяжестью заболевания (Antúnez et al., 2006; GemouEngesaeth et al., 2002).
Полученные результаты согласуются с описаннымиранее (Буравкова и др., 2011; Kronsteiner et al., 2011).Сокультивирование клеток мононуклеарных фракций с МСК из разныхисточников приводило к росту количества регуляторных Т-лимфоцитов сфенотипом CD4+CD25+CD127low, в то время как добавление алларгена вкультуральную среду клеток мононуклеарной фракции не оказывало влияниянаихчисленность.ПовышениевыживаемостиипролиферацияТ-регуляторных клеток под влиянием МСК является хорошо описаннымфеноменом (English et al., 2009, 2013; Duffy, 2011) и рассматривается как одиниз основных мезханизмов, опосредующих иммуносупрессорное действиеМСК. В первую очередь это было показано для Т-лимфоцитов с фенотипомCD4+CD25+FOXP3 в смешанной культуре МСК и иммуннокомпетентныхклеток здоровых доноров. При использовании в качестве тест-объектовклеток мононуклеарной фракции крови пациентов с аллергией на пылевогоклеща подобного эффекта не наблюдали (Kapoor et al., 2012).
Расхождениямогут быть обусловлены индивидуальными особенностями доноров. Вчастности, в нашей работе изначальное количество Т-регуляторных клеток истепень его изменения в присутствии МСК варьировала в образцах от разныхдоноров (Айзенштадт и др., 2015). Это хорошо видно при индивидуальном113представлении данных по каждому из доноров клеток мононуклеарнойфракции (Рис.4.1.).Рис.4.1. Содержание регуляторных Т-лимфоцитов (CD4+,CD25+,CD127low)относительно Т-клеток в составе мононуклеарных фракций после ихкультивирования в ростовой среде (контроль), или в среде с аллергенами(аллерген), или при сокультивировании с МСК из различных источников вприсутствии аллергенов.
По оси абсцисс – номера образцов. Звездочки сгоризонтальнымиотрезкаминаходятсянадданными,достоверноотличными от контроля (Р<0,05).Различиятакжемогутбытьсвязанысвыбороммаркеровдляидентификации Т-регуляторных клеток (Klein et al., 2010). Аналогично срезультатами нашей работы формирование популяции Т-регуляторных клетокс фенотипом CD4+CD25+CD127low наблюдали при сокультивировании МСК иклеток мононуклеарной фракции пациентов с обострением бронхиальнойастмы (Li et al., 2013).Согласно современным представлениям, снижение количества и (или)функциональной активности Т-регуляторных клеток может влиять на развитиеаллергической патологии (Akdis et al., 2005).
Например, сниженное количестворегуляторных Т-клеток было показано у пациентов с бронхиальной астмой иаллергическим ринитом (Ling et al., 2004). С другой стороны, повышение долиCD4+CD25+FOXP3+Т-регуляторныхклетокнаблюдаливобразцах114периферической крови пациентов с атопическим дерматитом, при этом былаустановлена положительная корреляция между количеством Т-регуляторныхклеток, индексом SCORAD (Scoring of atopic dermatitis, Kunz et al., 1997) исодержанием эозинофилов (Ito et al., 2009). Снижение функциональнойактивности Т-регуляторных клеток может быть компенсировано увеличениемих численности (Zhang et al., 2014).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
