Диссертация (1145849), страница 14
Текст из файла (страница 14)
После 24 часов инкубации с ФГА ядернаялокализация NF-κB сохранялась в 58,6 ± 19 % МСК87Рисунок 3.38. Локализация транскрипционного фактора NF-κB в МСК приинкубации с ФГА в течение 30 мин. Масштабный отрезок – 5 мкм.Обозначения те же, что на Рис. 3.36.Во второй серии экспериментов локализацию NF-κB в МСК анализировалив смешанной культуре с клетками мононуклеарной фракции периферическойкрови.
Контактное сокультивирование МСК с интактными лимфоцитами неиндуцировало транслокацию NF-κB в МСК (Рис.3.39).88Рисунок3.39.РаспределениеNF-κBвМСКприконтактномсокультивировании с интактными клетками мононуклеарной фракции втечение 90 мин. Обозначения те же, что на Рис. 3.38При контактном сокультивировании МСК и активированных митогеном(ФГА или ЛПС) клеток мононуклеарной фракции через 30 минут NF-κBобнаруживали в ядре в 35 ± 4,3% популяции МСК (Рис.
3.40.).894123123Рисунок3.40.РаспределениеNF-κBвМСКприконтактномсокультивировании с лейкоцитами в присутствии ЛПС в течение 30 мин.Стрелками показаны лимфоциты на поверхности МСК. 1,2 – ядра МСК, вкоторых завершилась транслокация NF-κB в ядро, 3,4 – ядра МСК, в которыхNF-κB локализован преимущественно в цитоплазме. Обозначения те же, что наРис. 3.36.Процесс транслокации NF-κB в ядро во всех клетках завершался не менеечем через 60-90 минут (Рис.3.41.).90Рисунок3.40.РаспределениеNF-κBвМСКприконтактномсокультивировании лейкоцитами в присутствии ФГА в течение 90 мин.Стрелкой показан лимфоцит на поверхности МСК.
Обозначения те же, что наРис. 3.36.При исключении прямого межклеточного контакта между МСК и клеткамимононуклеарнойфракции(сокультивированиесиспользованиемполупроницаемых мембран) скорость транслокации NF-κB в присутствии ЛПСили ФГА снижалась еще более значительно, чем это происходило принепосредственномклеточномконтакте.Насрокахменее3часовтранскрипционный фактор NF-κB был локализован только в цитоплазме. Придальнейшем культивировании (4, 6, 12 часов) перераспределение NF-κBпроисходило только в части клеток (доля клеток, в которых произошлатранслокация NF-κB, варьировала между экспериментами, но не превышала9160%).
Процесс транслокации завершался (т.е. NF-κB был локализован в ядреболее чем 90% клеток) спустя 24 часа культивирования (Рис.3.41.).Рисунок 3.41. Распределение NF-κB в МСК при сокультивировании слейкоцитами в присутствии ЛПС при использовании полупроницаемыхмембран при разной длительности культивирования. Обозначения те же, что наРис. 3.36.Перераспределение NF-κB в МСК происходило одинаково во всехпроанализированных культурах МСК, полученных из костного мозга, жировойткани, и пупочного канатика.
Временные интервалы, в которые наблюдалитранслокацию NF-κB, также были схожими для всех культур МСК.Таким образом, воздействие ЛПС, который является митогеном для Влимфоцитов, а также лигандом TLR4, вызывает транслокацию NF-κB в ядроМСК. Аналогичный процесс наблюдали при инкубации с ФГА – митогеном Тлимфоцитов.Этотпроцесспроисходиткаквотсутствиииммуннокомпетентных клеток, так и в смешанной культуре.При сокультивировании с активированными ЛПС или ФГА клеткамимононуклеарнойфракциитранслокацияNF-κBвМСКпроисходилазначительно позже.
Для проверки предположения о том, что в этом случае92транслокацияNF-κBиндуцированацитокинами,продуцируемымиактивированными лимфоцитами, локализацию NF-κB в МСК анализировалипри воздействии TNFα. Импорт транскрипционного фактора в ядро МСКнаблюдали через 30 минут после внесения TNFα в культуральную среду.Ядерная локализация NF-κB в МСК сохранялась в течение 4 часов, после чегоNF-κB обнаруживался преимущественно в цитоплазме клеток (3.42).Рисунок 3.42. Распределение NF-κB в МСК при инкубации с TNFα.Обозначения те же, что на Рис.
3.38.ТранслокацияNF-κBвядроМСКсопровождаласьповышениемконцентрации IL-6 в культуральной среде МСК в присутствии ЛПС, либо присокультивировании с клетками мононуклеарной фракции в течение 24ч.МСК конститутивно продуцируютIL-6, причем его концентрациявкультуральной среде различалась для образцов, полученных от разных доноров(Рис. 3.43). Была показана индивидуальная вариабельность уровня продукцииIL-6, не связанная с источником получения культур.932Концентрация ИЛ-6, пг/мл25073200596481501100500костный мозгжировая тканьпупочный канатикРисунок 3.43. Средние значения концентрации IL-6 в кондиционной среде прикультивировании культур МСК, полученных из костного мозга, жировой ткании пупочного канатика.
Цифры над столбиками – номера культур. Указаностандартное отклонение.Добавление ФГА в культуральную среду МСК (вне зависимости отисточника получения культуры) не приводило к значительному увеличениюконцентрации IL-6. Воздействие ЛПС индуцировало повышение концентрацииIL-6 в культуральной среде монокультуры МСК, в среднем, в 6,2 ± 1,3 раз.СокультивированиеМСКиклетокмононуклеарнойфракциибездобавления митогенов не вызывало изменения концентрации IL-6. ВоздействиеФГА на смешанную культуру клеток мононуклеарной фракции с МСКкостного мозга приводило к 25-кратному (25,2±2) увеличению концентрацииIL-6 по сравнению с монокультурой МСК и 13 – кратному (12,9±1,6) – посравнению с клетками мононуклеарной фракции в присутствии ФГА.Аналогично, в смешанной культуре с МСК жировой ткани концентрация IL-6возрастала в 39±8,5 и 23±7 раз, а с МСК пупочного канатика – в 27,5±6 и13±5,6 раз.Наибольший рост продукции IL-6 был показан для культур МСК,полученных из жировой ткани (Рис.3.44.).94Рисунок 3.44.
Концентрации IL-6 в среде при культивировании МСК,костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика в присутствии митогенов(ЛПС либо ФГА), либо при сокультивировании с интактными (МНФ) илимитоген-активированными клетками мононуклеарной фракции (МНФ+ФГА иМНФ+ЛПС). Указано стандартное отклонение. * – достоверные различия отконтроля при р<0,05.Степень изменения концентрации IL-6 в смешанной культуре МСК,полученных из разных источников и клеток мононуклеарной фракции привоздействии ЛПС по сравнению с монокультурами МСК или клеткамимононуклеарной фракции суммированы в Таблице 3.6.95Таблица 3.6.
Средняя кратность увеличения концентрацииIL-6вкультуральной среде в смешанной культуре МСК и клеток мононуклеарнойфракции (МНК) при стимуляции ЛПС по сравнению интактными МСК истимулированными ЛПС МСК или клетками мононуклеарной фракцииИсточник МСКСредняя кратность увеличения концентрации IL-6 посравнению с:МСК подинтактнымиМНК подвоздействиемМСКвоздействием ЛПСЛПС319 ± 35*45 ± 6,3*10 ± 3*630 ± 60*60 ± 9,5*21 ± 4,4*370 ± 56*45,8 ± 5,5*14 ± 3*Костный мозгЖировая тканьПупочныйканатик* – достоверные различия при р<0,05Воздействие TNFα на МСК также приводило к увеличению продукции IL-6(Рис.3.45). Наибольший рост продукции IL-6 был показан для культур МСК,полученных из жировой ткани.костный мозгжировая тканьпупочный канатикКонцентрация IL-6, пг/мл4500*4000*35003000*25002000150010005000контрольTNFαРисунок 3.45.
Изменение концентрации IL-6 в среде при культивированииМСК, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика вприсутствии TNFα. Указано стандартное отклонение. * – достоверные различияот контроля при р<0,05.Таким образом, увеличение продукцииIL-6 происходило в смешаннойкультуре МСК и клеток мононуклеарной фракции в присутствии как ЛПС, таки ФГА. Менее выраженное повышение концентрации IL-6 наблюдали при96воздействии ЛПС на монокультуру МСК. Воздействие ФГА на монокультуруМСК не приводит к значимому увеличению концентрации IL-6, не смотря нато, что индуцирует транслокацию транскрипционного фактора NF-κB в ядро.Описанные процессы происходили во всех образцах МСК, но степеньизменения продукции IL-6 отличалась в МСК, полученных из разныхисточников.Локализацию NF-κB и продукцию IL-6в МСК анализировали также вусловиях смешанной культуры со стимулированными специфическимиаллергенамиклеткамипроявлениямимононуклеарнойгиперчувствительности.фракцииВкровитечениепациентоввсегоспроцессасокультивирования (временные точки 10, 30, 60, 120, 180 минут и 24 часа),транскрипционный фактор NFkВ был локализован в цитоплазме МСК(Рис.3.46.).Рисунок 3.46.
Локализация NF-κB в МСК при сокультивировании слейкоцитами в присутствии аллергена в течение 90 мин. Обозначения те же,что на Рис. 3.36.Транслокация NFkВ в ядро МСК в данной экспериментальной моделипоказана не была. Изменение концентрации IL-6 также не происходило. При97этом проанализированные культуры МСК ингибировали проявления аллергенспецифических эффекторных реакций в условиях in vitro, как описано выше.Таким образом, изменение функционального состояния МСК при ихсокультивированиисаллерген-активированнымилимфоцитаминесопровождается ядерным импортом транскрипционного фактора NFκB.98Глава 4.
ОбсуждениеВсоответствииспоставленнойцельюбылопроведено изучениеростовых и иммунофенотипических характеристик МСК, выделенных изкостного мозга, жировой ткани и пупочного канатика человека, а также былипроанализированы проявления их функциональной активности в разныхэкспериментальных системах.МСК могут быть выделены из нескольких участков пупочного канатика, изкоторых наиболее часто используемыми являются Вартонов студень ипериваскулярное пространство пупочной вены. МСК, полученные из этих ниш,являются двумя отдельными популяциями с различными свойствами (Ishige etal., 2009; Carvalho et al., 2011).
Нами впервые было проведено исследованиеМСК периваскулярного пространства пупочной вены пупочного канатика набольшой выборке образцов, что позволило выявить некоторые характеристики,оказывающие влияние на эффективность получения клеток. Основнымфактором является временной промежуток между родами и моментом началаобработки пупочного канатика. Кроме того, количество МСК полученных изобразцов пупочного канатика новорожденных мужского пола было в среднемвыше, чем женского.Периваскулярное пространство пупочной вены характеризуется достаточновысокой концентрацией МСК - из одного образца пупочного канатикавозможно получение МСК в количестве, сопоставимом с получаемым привыделении МСК из 50-70 мл костного мозга, либо из 3-5 мл жировой ткани.Получение жизнеспособных и пролиферирующих МСК из пупочного канатикавозможно даже после длительной транспортировке (более 12 часов)биологического материала, что делает возможным создание биобанков культурМСК, полученных из данного источника.Учитывая, что in vivo МСК существуют в условиях гипоксии, исследованиехарактеристик МСК в свете их потенциального клинического применениятакже целесообразно проводить при пониженном содержании кислорода.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
