Диссертация (1145849), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Ранее слабое усиление экспрессии HLA-Iна поверхности МСК костного мозга наблюдали при воздействии ЛПС,которое однако, не оказывало влияния на взаимодействие МСК и ЕК (Giulianiet al., 2014). В упоминавшейся выше работе Crop с соавторами возможностьиндуцибельного увеличения уровня экспрессии HLA I была показана только науровне транскрипции. Уровень экспрессии возрастал в 6 или в 2 раза привоздействии провоспалительных цитокинов (TNFα, INFγ, IL-6) или послесокультивирования с ФГА-активированными лимфоцитами соответственно.При этом иммунофенотипически авторами было показано отсутствиеизменений в уровне экспрессии HLA I на поверхности МСК в обоих случаях(Crop et al., 2010).Такимобразом,МСКразличноготканевогопроисхожденияхарактеризуются восоким уровнем экспрессии HLA I класса, который можетиндуцибельно возрастать.
Усиление экспрессии HLA I на поверхности МСКможет сказываться на характере их взаимодействия с ЕК, поэтому уровеньэкспрессии HLA I является существенной характеристикой при аллогеннойтрансплантацииМСК,способнойповлиятьнаиммуногенностьивыживаемость МСК, а значит и на эффективность клеточной терапии.Таким образом, на большой выборке образцов было показано, что МСКпупочного кантика обладают значительно более высокой пролиферативнойактивностьюпосравнениюсМСКкостногомозга.Различиявпролиферативной активности между МСК пупочного канатика и жировойткани не так существенны и наблюдаются только на поздних пассажах.
Приэтом сравнение иммунофенотипа МСК, полученных из костного мозга,жировой ткани и пупочного канатика, проведенное в данной работе,свидетельствует о сходстве между клетками, полученными из разныхисточников, за исключением экспрессии CD10, CD13, CD90 и CD105.104Для сравнения функциональной активности МСК из костного мозга,жировой ткани и пупочного канатика было использовано несколькоэкспериментальных систем, в которых в качестве тест-объектов выступали Тили В-лимфоциты, а также В-клеточные линии. Это позволило определить теусловия, в которых проявляются общие свойства всех МСК, а также выявитьпараметры,прикоторыхоказываютсязначимымииндивидуальныеособенности культур МСК, выделенных от разных доноров.Согласно существующим в литературе данным, МСК могут влиять напроцессы, происходящие на каждом из этапов Т-клеточного ответа: приактивации Т-клеток, пролиферации и осуществления эффекторных функций.Полученные нами результаты свидетельствуют о достоверном увеличениисодержания Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD69, в присутствии МСК.При оценке влияния МСК на содержание CD69+ Т-лимфоцитов необходимоучитывать время между проведением анализа и моментом воздействиястимула на лимфоциты.
Это связано с тем, что экспрессия CD25 и CD69 нетолько сопровождает процесс активации Т-лимфоцитов (Mardiney et al.,1996), но и является признаком регуляторного фенотипа Т-клеток (Sakaguchiet al., 2008; Han et al., 2009). Более того, все изученные на данный моментмаркеры Т-регуляторных клеток также являются маркерами активации Тлимфоцитов (Corthay, 2009). Возможно, действие МСК на процессыактивации и приобретения регуляторного фенотипа Т-лимфоцитами являетсяразнонаправленным, что может затруднять интерпретацию полученныхданных, поскольку эти процессы могут идти одновременно.
Имеющиесялитературные данные были получены в ходе анализа содержания CD69+ Тлимфоцитов, который проводили не менее, чем через 24 часа после началасокультивирования и предъявления Т-лимфоцитам стимулирующего агента(Ramasamy et al., 2008; Saldanha-Araujo et al., 2012; Буравкова и др., 2014).Поэтому,возможно,авторынаблюдалинеусилениеактивацииТ-лимфоцитов, а приобретение ими регуляторного фенотипа под действиемМСК.
В нашей работе содержание Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD69,105проводили на более ранних сроках (3 часа), соответствующих пикуэкспрессии CD69 в качестве раннего маркера активации (Hamann et al., 1993).Таким образом, в первую очередь оценивали действие МСК на экспрессиюCD69, функционирующего в качестве костимуляционной молекулы. Еслиисходить из данного предположения, то МСК не оказывают негативногодействия на раннюю активацию Т-лимфоцитов, а, наоборот, ее стимулируют.С одной стороны, нельзя исключать, что даже на таких ранних сроках Тлимфоцитыначинаютприобретатьрегуляторныйфенотип.Однако,возможно, ранняя активация Т-лимфоцитов под влиянием МСК являетсянеобходимымпоследних,условиемучаствуявреализациипроцессеиммунносупрессивногоих«лицензирования».действияМеханизмы,задействованные при данных процессах, требуют дальнейшего изучения.При более длительном взаимодействии МСК с эффекторными клетками(72 ч) наблюдали блокирование ФГА-индуцированного увеличения Тлимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR, которые могут дополнительноусилить иммунный ответ на поздних стадиях.
Ранее снижение доли HLA-DR+Т-лимфоцитов в смешанной культуре с МСК было показано в случаеактивации Т-лимфоцитов антителами к CD3 и CD28 (Kronsteiner et al., 2011)и ФГА (Буравкова и др., 2011). Снижение содержания HLA-DR+ Тлимфоцитовможетбытькосвеннымсвидетельствомвозможностиприменения МСК из всех источников для лечения ревматоидного артрита,острой РТПХ и ряда других заболеваний, которые сопровождаютсяувеличением доли HLA-DR+ Т-лимфоцитов.Таким образом, МСК разнонаправлено действуют на экспрессию ранних ипоздних маркеров активации на поверхности активированных Т-лимфоцитов,Это может быть признаком чувствительности проявления функциональнойактивности МСК в зависимости от фазы иммунного ответа и факторовмикроокружения. В тоже время, сравнение МСК, полученных из костногомозга, жировой ткани и пупочного канатика, показывает, что характер и106выраженность влияния МСК на экспрессию маркеров активации Тлимфоцитов не зависит от источника получения МСК.Одним из наиболее часто используемых показателей функциональнойактивности МСК по отношению к иммуннокомпетентным клеткам являетсяподавление пролиферации Т-лимфоцтов в присутствии МСК, что былопоказано во многих работах (Di Nicola et al., 2002; Duffy et al., 2011).
Внастоящей работе основной задачей изучения влияния МСК на ФГАстимулированную пролиферацию Т-лимфоцитов было определить, все липроанализированные культуры МСК облают способностью к подавлениюпролиферативной активности Т-лимфоцитов, и влияет ли источник полученияМСК на выраженность наблюдаемого эффекта. Различия в проявлениифункциональной активности МСК в данной экспериментальной моделинаблюдалитолькопринизкойконцентрацииМСКотносительноэффекторных клеток. При соотношении 1:100, МСК костного мозга обладалименее выраженным супрессорным действием по сравнению с МСК жировойткани и пупочного канатика. Ранее сокультивирование МСК и эффекторныхклеток проводили при соотношении не меньше, чем 1:18 (Di Nicola et al.,2002; Yoo et al., 2009; Ribeiro et al., 2013). Соответственно и значительныхразличий в супрессивной активности по отношению к пролиферации Тлимфоцитов выявлено не было.
Хотя в работе Krampera с соавторамиотсутствие супрессорного действия МСК костного мозга на пролиферацию Тлимфоцитов было показано при соотношении ниже 1:10 (Krampera et al.,2006). Однако в клинической практике не используется количество МСК,после введение которого, соотношение МСК и лимфоцитов было быприближено к 1:1 или 1:10.
Таким образом, учитывая дозозависимостьвлияния МСК на пролиферацию Т-лимфоцитов и наличие влиянияиндивидуальных характеристик культур МСК (в том числе, источникаполучения) на взаимодействие МСК и Т-лимфоцитов, представляется важныманализировать культуры МСК для клинического применения в данном тесте сиспользованием различных соотношений МСК и лимфоцитов – от 1:1 до1071:100 или меньше. Такое тестирование может быть особенно важным, еслипредполагается использование МСК для лечения иммунопатологическихсостояний.
Возможно, анализ супрессорного действия МСК на пролиферациюТ-лимфоцитов должен быть включен в систему контроля качества МСК впроцессе подготовки культур для клинического применения.Наибольшую вариабельность функциональной активности МСК из разныхисточников наблюдали в экспериментальных системах с использованием вкачестве эффекторных клеток В-лимфоцитов или В-клеточных линий. Причем,изменяемые параметры по-разному влияли на характер взаимодействия МСК иВ-лимфоцитов, в зависимости от источника получения МСК, а такжеиндивидуальных характеристик культур.Определяющим фактором является соотношение МСК и лимфоцитов:МСК вне зависимости от источника получения подавляли пролиферацию Влимфоцитов при равном соотношении МСК и клеток мононуклеарнойфракции. При уменьшении доли МСК супрессивное действие МСК костногомозга, в отличие от МСК жировой ткани и пупочного канатика, быловыражено слабо.
Изучение изменения ЛПС-индуцированной пролиферацииВ-лимфоцитов в составе мононуклеарной фракции при сокультивировании сМСКвсоотношенииэкспериментальная100модель,к1можетпозволяющаябытьвыявитьиспользованокакиндивидуальныеособенности проявления функциональной активности отдельных культурМСК. Таким образом, при данных условиях сокультивирования действиеМСК на В-лимфоциты, как и на Т-лимфоциты, носит дозозависимый характери при снижении доли МСК зависит, в том числе, от характеристик МСК.Кроме того, при анализе влияния МСК на В-лимфоциты важнымпараметромэкспериментальноймоделибылоналичиедругихиммуннокомпетентных клеток. Наши данные свидетельствуют о том, что приотсутствии других иммуннокомпетентных клеток супрессивное влияние МСКна ЛПС-индуцированную пролиферацию В-лимфоцитов менее выраженно по108сравнению с сокультивированием с клетками мононуклеарной фракции.
Вкачестве объяснения этому феномену могут служить полученные недавноданныеотом,чтоподавлениепролиферацииВ-лимфоцитовМСКопосредовано Т-лимфоцитами (Rosado et al., 2015). Хотя результаты,приведенные в цитируемой работе, представляются убедительными, онинаходятся в противоречии с полученными ранее (Corcione et al., 2006; NanChe et al., 2012), а также нашими данными.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
