Диссертация (1145849), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Единичные работы посвященывлиянию TLR-опосредованного сигналинга на взаимодействие МСК с ЕК(добавление лигандов TLR3 и 4 препятствует лизису МСК ЕК) (Giuliani et al.,2013) и с В-лимфоцитами (воздействие на МСК лигандов TLR4 приводит кувеличению экспрессии фактора активации В-лимфоцитов, BAFF) (Yan et al.,2014). При сопоставлении результатов, полученных в разных работах,значимыми могут быть различия в уровне экспрессии TLR3 в МСК подвоздействием провоспалительныхцитокинов на эти клетки или присокультивировании их с иммунокомпетентными клетками.
Дополнительнымиисточниками противоречий в результатах могут быть вариации в постановкеэкспериментов (соотношение клеток, концентрации лигандов и т.д.), а такжеиндивидуальные различия доноров биологического материала (Romieu-Mourezet al., 2009).Несмотрянасуществующиевлитературеразногласия,вовсехисследованиях было показано, что культуры МСК являются однородными поэкспрессии TLR3 и TLR4.
Не было описано присутствия двух или болеепопуляций МСК, которые можно было бы отличить по уровню экспрессии этихрецепторов. Таким образом, субтипы МСК, описанные в работе Waterman cсоавторами(2010),соответствующимипо-видимому,лигандамивозникаюттолькочтосвоюTLR,вприиндукцииочередьможетсвидетельствовать о том, что субтипы МСК – это их функциональныесостояния, возникающие при «лицензировании» клеток.120Передача сигнала от TLR осуществляется по нескольким сигнальным путям,которые связаны с транскрипционным фактором NF-κB (Takeda, Akira, 2005).Согласно, нашим результатам, транслокация NFκB в ядро происходит вМСК из всех источников при взаимодействии с клетками мононуклеарнойфракции,активированнымимитогенами,атакжеподвлияниемнепосредственно лимфоцитарных митогенов: ЛПС и ФГА.
ЛПС являетсяклассическимлигандомTLR4,способнымактивироватьNF-κB-опосредованный сигнальный путь (Takeda, Akira, 2005). Для митогена Тлимфоцитов ФГА также не так давно была показана возможность связывания сTLR4 (Unitt et al., 2011).Воздействие и ЛПС, и ФГА приводило к транслокации транскрипционногофактора NF-κB в ядро МСК уже через 30 минут после их добавления вкультуральную среду. Ядерный импорт NF-κB в МСК под воздействием ЛПСсопровождался увеличением концентрации IL-6 в культуральной среде, аинкубация с ФГА не вызывала значимого увеличения концентрации IL-6, несмотря на транслокацию транскрипционного фактора в ядро.
Повышениеконцентрации IL-6 при воздействии ЛПС на МСК происходило во всехпроанализированных культурах, вне зависимости от источника получения.Однако, в МСК пупочного канатика, увеличение экспрессии IL-6 было менеезначительным по сравнению с МСК костного мозга и жировой ткани.Экпрессия IL-6 регулируется транскрипционными факторами NF-IL6 (Akira etal., 1992) и NF-kB (Novotny et al., 2008). Ранее значительное увеличениеэкспрессии IL-6 в МСК в ответ на воздействие ЛПС было показано внескольких работах (Giuliani et al., 2014; Romieu-Moures et al., 2009; Dorronsoroet al., 2014).
В упоминавшейся выше работе Raicevic наблюдали, что инкубацияс ЛПС стимулировала продукцию IL-6 в МСК костного мозга и жировой ткани,но не в МСК пупочного канатика (Raicevic et al., 2011). Различия, возможнотакже, обусловлены использованием МСК из разных регионов пупочногоканатика.121С одной стороны, наблюдаемый эффект является ожидаемым, т.к.активация TLR4-NFkB-сигнальных путейпод влиянием ЛПС - хорошоизвестный факт, но, с другой стороны, как было описано выше, TLR4 наповерхности МСК является трудно-детектируемым с помощью проточнойцитофлуорометрии, что свидетельствует об очень низкой плотности этогорецептора на поверхности МСК.
Кроме того, известно, что связыванию ЛПС сTLR4 предшествует взаимодействие ЛПС с CD14, который являетсякорецептором TLR4 (Park, Lee, 2013). Этот этап является необходимым дляфункционирования сигнального пути, особенно при низких концентрацияхЛПС (Zeuner et al., 2015). МСК из всех источников характеризуютсяотсутствием экспрессии CD14 на их поверхности, что мы также наблюдали напроанализированных культурах.Возможно, аффинитет связывания TLR4 c ЛПС может быть высоким и,поэтому, такой уровень экспрессии TLR4 является достаточным для активациисоответствующих сигнальных путей под действием ЛПС.
Также наличие CD14является критичным при низких концентрациях ЛПС (1 нг/мл), а в нашейработе ЛПС использовали в относительно высокой концентрации – 10 нг/мл.Кроме того, в качестве корецептора TLR4 при воздействии ЛПС могутфункционировать CD44 и CD36, тирозин киназа Lyn (Płociennikowska et al.,2015).В свою очередь ФГА, видимо, обладает меньшей эффективностьюсвязывания с TLR4, чем ЛПС. Кроме того, ФГА частично можетвзаимодействовать с гетеродимером TLR2/6 (Unitt et al., 2011), который такжеэкспрессируется в МСК (Grote et al., 2013).
То есть, ЛПС и ФГА различаютсяпо характеру взаимодействия с Toll-подобными рецепторами МСК, чтопроявлялось в наших экспериментах в разном влиянии на морфологию клетоки уровень продукции IL-6. Кроме того, ЛПС, в отличие от ФГА, был способенусиливать экспрессию TLR3.Таким образом, прямое воздействие лимфоцитарных митогенов на МСКспособно индуцировать в них активацию сигнальных каскадов, приводящих к122транслокацииNF-kB в ядро, что является необходимым условием длятранскрипции генов, регулируемых этим транскрипционным фактором. Этоможет быть одним из вероятных объяснений расхождения результатов,полученных in vitro при сокультивировании МСК с имммунокомпетентнымиклетками, активированными различными стимулами, а также с данными опроцессах,происходящихвМСКподвоздействиемотдельныхпровоспалительных цитокинов.
Скорее всего, роль, которую МСК могут игратьв месте воспаления является намного более сложной, чем представлялосьранее.Учитывая динамический контроль клеточного ответа, опосредованного NFκB (Covert et al., 2005), важным было сопоставить сроки транслокации NF-κB вядро МСК при их сокультивировании с активированными клеткамимононуклеарной фракции по сравнению с добавлением в среду толькомитогенов.
Согласно нашим данным, в смешанной культуре транслокация NFκB в МСК происходит на более поздних сроках по сравнению с воздействиемлимфоцитарных митогенов на монокультуру МСК: временной интервал впервом случае на 30-60 мин больше, чем во втором.Возможно, в смешанной культуре МСК и клеток мононуклеарной фракциичасть молекул стимулирующего агента (митогенов) сначала взаимодействует слимфоцитами, приводя к экспрессии в них провоспалительных цитокинов,которые в свою очередь действуют на МСК, либо влияя на межклеточныевзаимодействия между ними и имммунокомпетентными клетками. Одним изцитокинов, активирующим NF-κB-опосредованный сигнальный путь, можетбыть TNF-α (English etприсутствующимal., 2007), которыйна поверхностисвязывается с TNFR1,МСК (Dorronsoroetal., 2014).
Вподтверждение этому, импорт транскрипционного фактора NF-κB в ядро МСКмы наблюдали через 30 минут после начала воздействия TNFα.ПроцессыактивацииNF-κB-опосредованныхсигнальныхпутейнепосредственно под действием лимфоцитарных митогенов и под влияниеммедиаторов, выделяемых иммунокомпетентными клетками, могут идти123параллельно.Свидетельствомтакомупредположениюможетявлятьсянаблюдение о том, что в части популяции МСК в смешанной культуретранслокацию NF-κB наблюдали на ранних сроках. Кроме того, присокультивировании с активированными митогеном клетками мононуклеарнойфракции ядерная локализация NF-κB в МСК сохранялась в течение 24 ч, чтосущественно превышает время транслокации под влиянием TNFα.
TNFαвызывает кратковременный пик активности IKK, и TNFα-индуцированнаяактивация NF-κB завершается в течение примерно 8 часов. В нашихэкспериментах ядерная локализация NF-κB в МСК сохранялась в течение 4часов после воздействия TNFα, затем NF-κB обнаруживался преимущественнов цитоплазме клеток. Напротив, ядерная локализация NF-κB в результатеактивации TLRсохраняется на более поздних сроках, чем при активацииTNFR. Это происходит за счет экспрессии генов цитокинов, которыеобеспечивают положительную обратную связь,усиливая, таким образом,позднюю активацию IKK (Werner et al., 2008).Концентрация IL-6 в присутствии как ЛПС, так и ФГА, была значительновыше в смешанной культуре МСК и клеток мононуклеарной фракции посравнению с активированными этими митогенами монокультурами.
При этом,видимо,происходилоувеличениепродукцииIL-6ивМСК,ивиммунокомпетентных клетках, но не только под действием митогенов, а и какрезультат взаимного влияния компонентов смешанной культуры. Описанныепроцессы наблюдали при анализе всех образцов МСК, но наибольшееувеличение продукции IL-6 происходилопри сокультивировании с МСКжировой ткани.Приведенные выше данные являются возможным объяснением различий впрофилях экспрессии МСК, полученных при сокультивировании МСК сактивированнымилимфоцитамииподвоздействиемотдельныхпровоспалительных факторов, которые они синтезируют (Crop et al., 2010).Транслокация NF-κB в МСК не происходила при их сокультивировании синтактнымиклеткамимононуклеарнойфракции,чтоможетслужить124косвеннымподтверждениемкомпонентовосуществленияиммуннойиминеобходимостисистемы,т.е.поступления«лицензирования»иммуномодулирующихсвойств.сигналаотМСКдляОднакоследуетупомянуть исследование Dorronsoro c соавторами (2014), в котором ядернаятранслокация NF-κB в МСК была показана при их сокультивировании снеактивированными Т-лимфоцитами, которые были выделены с помощьюиммунномагнитной сепарации.
В этом случае активация лимфоцитов моглапроизойти в процессе выделения Т-лимфоцитов из мононуклеарной фракции.При этом в смешанной культуре МСК и активированных Т-лимфоцитов(стимуляцию Т-лимфоцитов проводили частицами, покрытыми антителамипротив CD3/СD28 и IL-2) авторы наблюдали транслокацию уже через 30 минутпосле начала сокультивирвоания. Также наши данные отличаются отполученных в исследовании Chen c соавторами, которые наблюдалитранслокациию NF-κB при воздействии ЛПС на МСК не ранее, чем через 2часа (Chen et al., 2013). Таким образом, сроки транслокации NF-κB могутизменяться в зависимости от условий постановки эксперимента, иллюстрируяпластичность проявления функциональной активности МСК в зависимости отпараметров экспериментальных систем.Дополнительным фактором, влияющим на сроки транслокации NF-κB,согласно нашим данным, является наличие прямого межклеточного контактамеждуМСКииммунокомпетентнымиклетками.Необходимостьмежклеточного контакта для реализации иммуномодулирующих свойств МСКдо сих пор является дискуссионным вопросом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
