Диссертация (1145849), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Входесериипредварительныхэкспериментовповыборуусловий99культивирования было показано, что культивирование МСК из разныхисточников в условиях гипоксии приводит к повышению их пролиферативногопотенциала. При этом морфологические характеристики клеток не изменяются,что соответствует полученным ранее данным (Буравкова и др., 2011; Hoch,Leach, 2014)МСК,выделенныеизпупочногоканатика,обладаютбольшейпролиферативной активностью, чем МСК костного мозга.
Аналогичныерезультаты были получены ранее (Baksh et al., 2007). Кроме того, былипоказаны различия в пролиферативной активности между МСК пупочногоканатика и жировой ткани, которые, однако, возникали только при длительномкультивировании – МСК пупочного канатика дольше сохраняли способностьпролиферировать (до 10 пассажа) и на поздних пассажах (с 6 пассажа)характеризовались меньшим временем удвоения популяции, чем МСК жировойткани. При этом МСК из всех источников имели в целом сходныеморфологическиедифференцироватьсяхарактеристикивостеогенном,иобладалихондрогенномспособностьюиадипогенномнаправлениях.Таким образом, периваскулярное пространство пупочной вены являетсянишей, из которой может быть получено значительное количество МСК свысоким пролиферативным потенциалом. Такое свойство может быть весомымпреимуществом при выборе МСК пупочного канатика для клиническогоприменения.Культуры МСК, полученные из разных источников, характеризовались вцелом одинаковым содержанием клеток, несущих МСК-ассоциированныемаркеры, за исключением CD10 и CD13.CD10 вовлечен в активацию клеточной адгезии, опосредованной киназойфокальных контактов, таким образом, негативно влияя на способность клеток кмиграции (Sumitomo et al., 2005).
Согласно нашим результатам, в культурахМСКпупочногоканатикаприсутствуетпопуляцияклеток,неэкспрессирующих CD10, относительное содержание которых существенно100выше, чем среди МСК, выделенных из костного мозга и жировой ткани.Значительное количество МСК пупочного канатика, не экспрессирующихCD10,наблюдаливнезависимостиотконцентрациикислородаприкультивировании. В тоже время в работе Farias с соавторами упоминается, чтовсе МСК пупочного канатика экспрессируют данный маркер (Farias et al.,2011).
Гетерогенность популяции по экспрессии CD10 была так же показанадля культур МСК костного мозга, но при культивировании в условияхнормоксии. При этом авторы наблюдали прямую корреляцию между уровнемэкспрессии CD10 и эффективностью адипогенной дифференцировки (Siegel etal., 2013). По нашим данным, в результате культивирования в условияхгипоксии CD10+ клетки в культурах МСК жировой ткани и костного мозгасоставляют более 80% и 90% популяции, сооответственно.Активация CD13 также как и CD10 может приводить к усилению клеточнойадгезии (Mina-Osorio et al., 2008; Subramani et al., 2013). МСК костного мозга ижировой ткани являются однородными по экспрессии CD13 (Musina et al.,2005; Vishnubalaji et al., 2012), что было подтверждено и в нашемисследовании. По данным ряда авторов, в культурах МСК пупочного канатикаболее 90% клеток экспрессируют CD13 (Panepucci et al., 2004; Weiss et al., 2006;Ishigeetal.,2009).Однаковцитируемыхисследованияхиммунофенотипирование проводили для небольшого количества культур МСКпупочного канатика.
Кроме того, для анализа использовали МСК на 3, 4 илидаже 8 пассаже. Нами было показано, что МСК пупочного канатика на второмпассаже гетерогенны по экспрессии CD13, при этом доля CD13+ клеток,сильно варьировала между разными культурами.Учитывая вовлеченность CD10 и CD13 в регуляцию процессов миграции иклеточной адгезии, гетерогенность МСК пупочного канатикапо экспрессииэтих антигенов может быть существенной при системном введении МСК,эффективность которого во многом зависит от способности МСК к миграции.Все МСК в культурах, полученных из костного мозга, жировой ткани ипупочного канатика, экспрессируют CD90.
При этом МСК костного мозга101характеризовалисьболеенизкимизначениямисреднейинтенсивностифлуоресценции МСК, экспрессирующих CD90, по сравнению с МСК из другихисточников, что свидетельствует о различной плотности изучаемого антигенана поверхности клеток в зависимости от их тканевого происхождения. Ранееразличия в уровне экпрессии CD90 на поверхности МСК из разныхисточников,былипоказанынапримерекультур,выделенныхизсубэпикардиальной и подкожной жировой ткани (Крылова и др., 2014).Существуют данные, свидетельствующие о том, что низкая экспрессияCD90наповерхностиМСКкоррелируетсоснижениемихиммуносупрессорной активности, что, возможно, опосредовано снижениемпродукции неклассического антигена HLA-G и IL-10 (Campioni et al., 2009).Аналогично, в нашей работе при сокультивировании МСК костного мозга склетками мононуклеарной фракции была показана меньшая концентрация IL10, чем в смешанных культурах с МСК жировой ткани или пупочногоканатика, что может быть косвенным свидетельством меньшей выраженностииммуносупрессорных свойств МСК из этого источника.Высокий уровень экспрессии CD90 в МСК пупочного канатика может бытьчастично связан с возрастом донора биологического материала.
Так, в работеSiegel с соавторами была показана обратная зависимость уровня экспрессииCD90 от возраста донора (Siegel et al., 2013). Однако данное объяснение неподходит для МСК жировой ткани, поскольку возраст доноров жировой тканисоставлял от 46 до 90 лет. Кроме того, культуры МСК пупочного канатикахарактеризовались максимальной внутригрупповой дисперсией показателейинтенсивностифлуоресценцииCD90. Приэтом не удалось выявитькорреляцию уровня экспрессии с каким-либо параметром в анамнезе роженицы(возраст, срок гестации, наличие гипоксии плода и т.д.), либо в процедуревыделения клеток (временной интервал между родами и выделением клеток,свойства пупочного канатика). Таким образом, была показана зависимостьуровня экспрессии CD90 на поверхности МСК от их тканевого происхождения.102МСК пупочного канатика в отличие от МСК костного мозга и жировойткани были однородны по экспрессии CD105.
Ранее различия в уровнеэкспрессии CD105 были показаны также для МСК костного мозга и жировойткани (Rada et al., 2011; Aslan et al., 2006; Jiang et al., 2010; Levi et al., 2010).МСК пупочного канатика при этом характеризуются постоянным, нодостаточно низким уровнем экспрессии CD105. Кроме того, на МСК,полученных из пуповинной крови человека, было показано, что снижениеэкспрессииCD105наблюдаетсявходедифференцировкиклетоквостеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях (Jin et al., 2009).При иммунофенотипировании культур МСК отдельно анализировалиуровень экспрессии HLA I класса.
Ранее было показано, что МСКэкспрессируют HLA I класса (Le Blanc et al., 2006), но в ряде статейупоминается низкий уровень экспрессии HLA I в качестве одной изхарактеристик фенотипа МСК (Климович, 2014; Newman et al., 2009; Franquesaet al., 2012), однако экспериментального подтверждения данному факту найтине удалось. Напротив, наши результаты свидетельствуют о том, что МСК,полученные из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика,экспрессируют HLA I класса практически на том же уровне, что и лимфоцитыпериферической крови.
Это согласуется с работой Crop с соавторами, вкоторой высокий (по сравнению с другими типами клеток) уровень экспрессииHLA I был продемонстрирован с помощью микрочипов (Crop et al., 2010).Наши данные были получены с использованием поликлональных антител кбелкам, которые кодируются генами системы HLA I класса всех трех локусов –А, В и С. Ранее также методом проточной цитофлуорометрии было показано,что МСК жировой ткани и костного мозга конститутивно на достаточновысоком уровне экспрессируют гены локуса A, при этом практически неэкспрессируют HLA-B (Isa et al., 2010). Значение данного факта требуетдальнейшего изучения.Намивпервыеметодомпроточнойцитофлуорометриибылопродемонстрировано повышение уровня экспрессии HLA I на поверхности103МСК при сокультивировании МСК с ФГА- или ЛПС-активированнымиаллогеннымилимфоцитами,либопридобавленииккультуреМСКпровоспалительного цитокина TNFα.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
