Диссертация (1145849), страница 13
Текст из файла (страница 13)
* - данные,достоверно отличные от контроля (Р<0,05).Присутствиеаллергеноввсредекультивированияиндуцировалодостоверное увеличение концентраций IL-4. Сокультивирование клетокмононуклеарной фракции с МСК блокировало вызванный аллергеном ростконцентрации IL-4 (Рис.3.30) (Айзенштадт и др., 2014).*Рисунок 3.30. Концентрация IL-4 в среде после культивирования клетокмононуклеарных фракций в ростовой среде (контроль), или в среде саллергенами (аллерген), или при сокультивировании с МСК из разныхисточников в присутствии аллергенов. * - данные, достоверно отличные отконтроля (Р<0,05).79Для двух доноров не было показано статистически значимых отличиймежду интактными и стимулированными аллергеном лимфоцитами, а также вварианте сокультивирования с МСК (Образцы № 6 и 7).
МСК из костногомозга, жировой ткани или пупочного канатика блокировали продукцию IL-4 содинаковой эффективностью.В тоже время, при воздействии ФГА на клетки мононуклеарной фракции,сокультивирование с МСК приводило к незначительному увеличениюконцентрации IL-4 в культуральной среде в экспериментах с материалом всехдоноров (Рис.3.31).Концентрация IL-4, пг/мл4,5*43,5*#3*# *#*2,5МНКкостный мозгжировая тканьпупочный канатик21,510,50-0,5контрольРисунок3.31.аллергенСодержаниеФГАIL-4вкультуральнойжидкостиприсокультивировании клеток мононуклеарной фракции с МСК из костного мозга,жировой ткани и пупочного канатика в присутствии аллергенов или ФГА. * данные, достоверно отличные от контроля (мононуклеарная фракция безстимула) (Р<0,05).
По оси ординат – концентрация IL-4 (нг/мл).Таким образом, МСК предотвращали увеличение концентрации IL-4 пристимулировании лимфоцитов аллергеном, но не подавляли продукцию IL-4 вприсутствии ФГА. То есть, характер влияния МСК на уровень продукции IL-4зависит от стимулирующего агента, предъявляемого иммуннокомпетентнымклеткам.80Инкубациясаллергеномприводилакдостоверномуувеличениюконцентрации IgE. Рост концентрации IgE в присутствии аллергена ненаблюдали при сокультивировании клеток мононуклеарной фракции с МСК(Рис.3.32).
МСК, полученные из костного мозга, жировой ткани и пупочногоканатика, оказывали сходное влияние на содержание IgE.*Рисунок 3.32. Концентрация IgE в среде после культивирования клетокмононуклеарных фракций в ростовой среде (контроль), или в среде саллергенами (аллерген), или при сокультивировании с МСК из разныхисточников в присутствии аллергенов.
* - данные, достоверно отличные отконтроля (Р<0,05).Такимобразом,всекультурыМСКблокировалииндуцированноеаллергеном увеличение концентрации IgE в смешанной культуре с клеткамимононуклеарной фракции (Айзенштадт и др., 2015).Суммируя результаты представленные в данном разделе, можно сделатьвывод, что отличия в проявлении иммуносупрессорных свойств МСКразличноготканевогопроисхожденияпроявляютсятольковчастиэкспериментальных систем. Они проявлялись при анализе влияния МСК напролиферацию Т- и В-лимфоцитов (при низкой концентрации МСКотносительноэффекторныхклеток),продукциюиммуноглобулиновВ-клеточными линиями, а также изменение концентрации IL-10. МСК из81костного мозга имели менее выраженное влияние, чем МСК полученные изпупочного канатика и жировой ткани.3.6.
Влияние клеток мононуклеарной фракции крови и лимфоцитарныхмитогенов на функциональное состояние МСКИзменение функционального состояния МСК оценивали по уровнюэкспрессии TLR3 и TLR4, характеру внутриклеточного распределения NF-κB спомощью методов проточной цитофлуорометрии и иммуноцитохимии. Дляэтого МСК культивировали совместно с клетками мононуклеарной фракции,активированными лимфоцитарными митогенами (ФГА или ЛПС).
Контролемслужили монокультуры МСК, которые инкубировали с ФГА или с ЛПС. Всеэксперименты проводили в двух повторностях на 3 культурах МСК из каждогоисточника, полученных от разных доноров.3.6.1. Экспрессия Toll-подобных рецепторов на мембране МСКУровень экспрессии TLR3 и TLR4 на поверхности МСК, полученных изкостного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, исследовали методомпроточнойцитофлуорометриисиспользованиемпоказателясреднейинтенсивности флуоресценции.МСК конститутивно экспрессируют TLR3. При сравнении культур МСКжировой ткани и лимфоцитов периферической крови, полученных от одних итех же доноров (3 здоровых донора) было показано, что уровень экспрессииTLR3 на поверхности МСК выше, чем на поверхности лимфоцитов (CD45+)(Рис.3.33).Рисунок3.33.Гистограммаинтенсивностифлуоресценции МСК костного мозга (черная линия) илимфоцитов периферической крови (гистограмма ссерым фоном), экспрессирующих TLR3.
Пунктирнаялиния – изотипический контроль.82Было продемонстрировано индуцибельное усиление экспрессии TLR3 наповерхностиМСК.флуоресценцииНаибольшееМСК,увеличениеэкспрессирующихсреднейTLR3,интенсивностинаблюдалиприихсокультивировании с клетками мононуклеарной фракции в присутствиилимфоцитарных митогенов: ФГА или ЛПС - на 105±22 % и 120±35%,соответственно. Воздействие ЛПС на монокультуру МСК приводило кувеличению интенсивности флуоресценции МСК, экспрессирующих TLR3, на29,5±11,3 %. Уровень экспрессии TLR3, а также степень его изменения независели от источника МСК. (Рис.3.34.)35костный мозгжировая тканьпупочный канатик30*MFI, отн.ед.25* *2015* *****1050КонтрольконтрольРисунокФГАФГА3.34.ЛПСЛПССредняяМНФМНКМНФ+ФГАМНФ+ЛПСМНК+ФГАМНК+ЛПСинтенсивностьфлуоресценцииМСК,экспрессирующих TLR3 в присутствии митогенов (ЛПС либо ФГА), либо присокультивировании с интактными (МНФ) или митоген-активированнымиклетками мононуклеарной фракции (МНФ+ФГА или МНФ+ЛПС).
Указаностандартное отклонение. * – достоверные различия от контроля при р<0,05.МСК, полученные из разных источников, характеризуются уровнемэкспрессии TLR4 (Рис.3.35), который был трудно детектируемым с помощьюпроточной цитофлуорометрии.Экспрессия TLR4 не изменялась привоздействии митогенов, а также в процессе сокультивирования с клеткамимононуклеарной фракции (Рис.3.35).83КМЖТСредняя интенсивность флуоресценции, отн.ед.А1,21Б0,80,60,40,20контрольКонтрольРисунокФГАФГА3.35.ЛПСЛПСА.клеткиМНКМНФклетки МНК клеткиМНКМНФ+ФГАМНФ+ЛПСГистограмма+ФГА+ЛПСинтенсивностифлуоресценции МСК (полученных из костного мозга - КМ,ПКжировой ткани – ЖТ и пупочного канатика – ПК),экспрессирующихTLR4;Б.Средняяинтенсивностьфлуоресценции МСК из всех источников, экспрессирующихTLR4.
Обозначения как на Рис. 3.34Таким образом, уровень экспрессии TLR3 и TLR4 на поверхности МСК независит от их тканевого происхождения. Аналогично, характер измененияуровня экспрессии TLR3 и TLR4 был сходным у культур МСК из разныхисточников.3.6.2. Локализация транскрипционного фактора NF-κB в МСК при действиилимфоцитарных митогенов или при сокультивировании с лимфоиднымиклеткамиВ интактных МСК NF-κB находится в цитоплазме и не обнаруживается вядре.Каквиднотранскрипционногоизфакторамикрофотографиичастично(рис.3.38.),солокализованысубъединицысэлементами84актинового цитоскелета, в частности располагаются вдоль актиновых стрессфибрилл.Рисунок 3.36.
Распределение транскрипционного фактора NF-κB винтактных МСК. Красным отмечены структуры актинового цитоскелета,окрашенные родамин-фаллоидином (RhPH), зеленым – антитела к субъединицеp65 и вторые антитела, конъюгированные с флуорохромом Alexa-488, синим –85ядра клеток, окрашенные DAPI.
Флуоресцентная микроскопия. Масштабныйотрезок – 10 мкм.В первой серии экспериментов МСК инкубировали с ЛПС либо с ФГА втечение 5, 15, 30, 60, 180 мин и 24 ч.Транслокация транскрипционного фактора NF-κB в ядро происходила через30 минут после воздействия ЛПС (Рис.3.37.) во всех клетках. Изменениелокализации NF-κB не сопровождалось перестройками актинового цитоскелетаво все периоды наблюдения.Рисунок 3.37. Локализация транскрипционного фактора NF-κB в МСК приинкубации с ЛПС в течение 30 мин. Масштабный отрезок – 5 мкм Обозначенияте же, что на Рис.
3.36.86После 24 часов инкубации с ЛПС локализация NF-κB в ядре МСКсохранялась в 82,1 ± 7% клеток (Рис.3.37.).Alexa488DAPIAlexa488RhPhРисунок 3.37. Локализация транскрипционного фактора NF-κB в МСК приинкубации с ЛПС в течение 24 ч. Масштабный отрезок – 5 мкм. Обозначенияте же, что на Рис. 3.38.Воздействие ФГА также вызывало транслокацию NF-κB в ядро МСК.Изменение локализации транскрипционного фактора происходило в течение 30минут во всех клетках. Воздействие ФГА также приводило к изменениюморфологииМСК:наповерхностимембраныклетокформировалисьвыпячивания. (Рис.3.38.).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
