Диссертация (1145791), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Готовили сагиттальные и поперечныесрезы зародышей вьюна начиная со стадии 11. Для исследования ЖСС личинок делалипоперечные, парасагиттальные и фронтальные срезы.Срезы окрашивали гематоксилином Караччи (40 мин.-1 ч.) с докраской эритрозином(раствор в 70° спирте, 2-3 мин.) или железным гематоксилином по Гейденгайну [протравливание3% раствором железоаммонийных квасцов (0,5-1 ч. при 37ºС), окрашивание (0,5-1 ч.
при 37ºС),дифференцировка 1,5% раствором железоаммонийных квасцов (1,5-3 мин)].Препараты изучали с помощью светового микроскопа Carl Zeiss Primo Star ифотографировали в РЦ “Хромас” СПбГУ посредством микроскопа Leica DMPXA, оснащенного44цифровой камерой Leica DC 500, либо в РЦ РМиКТ с помощью микроскопа Leica DMI6000, либоиспользовали микроскоп LeicaDM2500, оснащенный цифровой камерой Nikon DS-Fi1. Дляобработки изображений применяли программу Adobe Photoshop 7.0.3.3. Трансмиссионная электронная микроскопияЛичинок данио-рерио фиксировали по двум схемам. В соответствии рекомендациямиСеменова и коллег (Семенов, 1989, 1995, 1996аб; Ахундов и др., 1995) была сделана фиксация2,5% или 2% раствором глутарового альдегида на фосфатном буфере (2,5 ч.
или 3 ч.соответственно при 4º С), трехкратная промывка в фосфатном буфере по 15 минут в каждой егосмене. По второй схеме материал фиксировали 1,5% глутаровым альдегидом на какодилатномбуфере при комнатной температуре и при 4ºС (Faas et al., 2012), после чего троекратно промывалив какодилатном буфере (по 15 минут). В обоих случаях для постфиксации использовали 1%раствор OsO4 на соответствующем буфере. Пришли к заключению, что фиксация 2-2,5%глутаровым альдегидом при температуре 4ºС предпочтительней (Кондакова, Ефремов, 2014).Материал дегидратировали и заливали в эпон-аралдит в соответствии со стандартнойпроцедурой.
Полутонкие (200 нм) и ультратонкие срезы (70-80 нм) получали с помощьюультратомов Leica EM UC6. Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим. Ультратонкиесрезы помещали на медные сеточки и контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца спомощью автоматической системы контрастирования. Ультратонкие срезы изучали ифотографировали с помощью электронных микроскопов JEOL JEM 1400 и JEOL JEM 2100 в РЦРМиКТ.3.4. МорфометрияДля морфометрии использовали материал, зафиксированный жидкостью Буэна. Срезыфотографировали при помощи микроскопов Leica DMI6000 и Leica DM4000 в РЦ РМиКТСПбГУ. Для измерений применяли программы Leica LAS Core и Fiji (Schindelin et al., 2012).Толщина ЖСС гаструл муксуна (n =4), данио-рерио (75% эпиболии, n=3) и обыкновенноговьюна (стадия 11, n=4 и стадия 16, n=4) была измерена на парасагиттальных и сагиттальныхсрезах в дорсальной, анимальной и вентральной областях, 8-20 срезов на зародыш.
Различиямежду дорсальной и вентральной областями оценивали при помощи критиерия Манна-Уитни.Уровень значимости: P < 0.05.Диаметр или длину ядер ЖСС и диплоидных ядер (ядра глубинных клеток и клетоккишечного эпителия) измеряли на парасагиттальных и сагиттальных срезах на стадиях гаструлыи личинки. Измеряли по 29-84 ядер ЖСС и по 29-50 диплоидных ядер на зародыша или личинку.45У данио-рерио это были стадии 75% обрастания (n=3), личинки в возрасте 5-6 дней послеоплодотворения (n=3). У вьюна – стадии 10 и 14, дополнительно – стадия 21, а также 7 дней послевылупления (n=2). У муксуна количество зародышей составило 4, личинок – 2.
Также наличиночных стадиях были измерены ядра ЖСС и кишечного эпителия карпа (n=3) и трехиглойколюшки (n=4). Чтобы минимизировать риск повторного измерения одного ядра, междуизмеряемыми срезами оставляли от 3 до 15 срезов. Все данные представлены каксреднее±стандартная ошибка среднего.464. РЕЗУЛЬТАТЫ4.1. Danio rerioНа стадиях продолговатой и сферической бластулы внутренняя часть ЖСС утолщена вобласти под центром бластодермы; она наполнена желточными включениями, тогда как внаружной области ЖСС желточные включения немногочисленны. Преимущественнаялокализация желточных включений во внутренней области сохранится и на последующихстадиях (Рисунок 6). Какие-либо различия между проспективными дорсальной и вентральнойсторонами ЖСС не очевидны.
В ЖСС можно видеть митотические фигуры и интерфазные ядра(Рисунок 6А, 7). На стадиях периода бластулы размер большинства ядер ЖСС тот же, что и ядерклеток бластодермы, или превышает его примерно в 1,5 раза. На стадии сферической бластулыиногда встречаются ядра, в два раза крупнее диплоидных ядер. На стадии куполообразнойбластулы внутренняя часть ЖСС выпячивается в направлении анимального полюса, чтосовпадает по времени с началом эпиболии. После образования куполообразного выпячиваниявнутренняя часть ЖСС оказывается тоньше наружной (Рисунок 6Б).Рисунок 6. - Бластула данио-рерио.НеравномерныетолщинаЖССираспределение желточных включений.Продольные срезы.
Окраска железнымгематоксилином по Гейденгайну. (A)Стадиясферическойбластулы.Митотические фигуры и желточныевключения во внутренней области ЖСС.(Б) Стадия куполообразной бластулы.МитотическиеЖелточныефигурыотсутствуют.включения,какинапредыдущей стадии, сосредоточены вовнутреннейобласти.кб-клеткибластодермы; пж - пластинка желтка; я ядро ЖСС. Масштаб: A, Б = 50 μm.47Рисунок 7. - ЖСС данио-рерио на стадиисферическойбластулы.(А-окраскагематоксилином Караччи с эритрозином; Б окраскажелезнымгематоксилиномпоГейденгайну). Продольные срезы. (А, Б)УтолщеннаянаполненнаяцентральнаяобластьжелточнымиЖСС,включениями.Видны микротрубочки. Клетки бластодермытакже содержат желточные включения.
жв –желточноебластодермы;включение,пж-кб-клеткапластинкажелтка.Масштаб: А = 50 µm, Б = 10 µmДо стадии 50% обрастания включительно большинство ядер ЖСС правильной округлой илиэллиптической формы, хотя встречаются ядра бобовидной, каплевидной, продолговатой илинеправильной формы (Кондакова, 2012; Kondakova, Efremov, 2014a) (Рисунок 8А). К стадии 75%эпиболиипоявляетсябольшеечислоядернеправильнойформы(Рисунок8Б).Рисунок 8. - Ядра ЖСС данио-рерио во время гаструляции. Рисунок показывает усложнениеформы ядер ЖСС и увеличение их размеров. (А - окраска железным гематоксилином поГейденгайну; Б - окраска гематоксилином Караччи с эритрозином).
Продольные срезы. (А)48Стадия 50% эпиболии. Крупные округлые, элиптические и изогнутое ядра ЖСС. (Б) Стадия 75%эпиболии. Гигантское ядро ЖСС неправильной формы в сравнении с диплоидными ядрамиглубинных клеток бластодермы. кб - клетка бластодермы; пж - пластинка желтка; я - ядро ЖСС.Масштаб: А, Б = 10 µm.На стадии 75% обрастания средняя длина ядер ЖСС составляет 12,02±0,30 μm, тогда какдлина диплоидных ядер глубинных клеток 6,86±0,08 μm. Максимальная отмеченная длина ядерЖСС - 36,46 μm.
В ходе эпиболии краевая часть ЖСС утончается. Различия по толщине междудорсальной (в области зародышевого щитка) и вентральной областями не очевидны и статическине значимы (Рисунок 9). На стадии 75% эпиболии средняя толщина дорсальной сторонысоставляет 3,18± 0,21 μm, вентральной - 2,81±0.16 μm.Рисунок 9.
- ЖСС данио-рерио во время гаструляции. Внутренняя область ЖСС тонкая; отличияпо толщине между дорсальной (область под зародышевым щитком) и вентральной областямиЖСС незначительна. (А - окраска железным гематоксилином по Гейденгайну; Б - окраскагематоксилином Караччи с эритрозином). Парасагиттальные срезы. (А) Стадия 50% эпиболии.(Б) Стадия 75% эпиболии. зщ – зародышевый щиток, пж – пластинка желтка.На стадии хвостовой почки характеристики слоя цитоплазмы ЖСС следующие: сдорсальной стороны ЖСС утолщается в каудальном направлении, особенно под хвостовойпочкой и между смыкающимися краями бластодермы, где можно видеть многочисленныеполиморфные крупные ядра: овальные, округлые, каплевидно вытянутые, многолопастные идвухлопастные (Рисунок 10).
В других областях ЖСС сравнительно тонок. В латеральнойобласти ядра разного размера, преимущественно одиночные, хотя встречаются пары и тройки49ядер. Эти ядра в основном эллиптические или округлые, но также представлены ядранеправильной формы. Вентрально и латерально к ЖСС прилежат мелкие пластинки желтка,тогда как в глубине и дорсально желток представлен более крупными пластинками.Рисунок 10. - ЖСС данио-рерио на стадиихвостовой почки. Скопление цитоплазмыЖСС в области закрытия желточной пробки.ОкраскажелезнымгематоксилиномпоГейденгайну. (А) Парасагиттальный срез. (Б)Поперечныйсрез.Многочисленныеполиморфные ядра ЖСС. хп – хвостоваяпочка, я - ядро ЖСС.
Масштаб: А = 20 µm, Б =10 µm.На стадиях 3-5 пар сомитов ЖСС утолщен в дорсальной и каудальной областях,(преимущественно под хвостовой почкой и под сомитами). Толщина дорсальной области ЖССплавно возрастает в переднезаднем направлении, как видно на рисунках 11 А, 11 Б, 11 В. Подголовой толщина ЖСС минимальна. В дальнейшем происходит последовательное истончениедорсальной части ЖСС. На рисунке 11 Г показан поперечный срез зародыша на стадии 9 парсомитов.Как было сказано выше, ЖСС увеличен в каудальной области, но его толщина несколькоменьше в области Купферовского пузырька.
До образования вытянутой части ЖМ купферовскийпузырек прилежит к ЖСС (Рисунок 11 Б). На рисунке 11Д можно видеть срез через вытянутуючасть ЖМ: ЖСС отделен от Купферовского пузырька мезодермой хвостовой почки.50Рисунок 11. - ЖСС данио-рерио в период сегментации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
