Диссертация (1145791), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Кроме того, сходные черты, связанные сусвоением желтка, наблюдаются у систем с принципиально различной организацией.2.4. Нерешенные вопросыСуществуетмножествонерешенныхвопросов,касающихсяорганизации,функционирования и деградации ЖСС Teleostei. Большинство работ выполнено на модельныхобъектах, таких, как данио-рерио. Можно сказать, что в настоящее время в изучении ЖСС восновном преобладает анализ экспрессии генов, продукты которых вовлечены в те или иныеморфопроцессы. О паттернах экспрессии различных генов в ЖСС известно больше, чем об ихспецифических функциях и регуляции. Многое относительно морфогенетической функции ЖСС40и его участия в обрастании остается неясным. Практически не исследована регуляция активностиЖСС сигналами от структур зародыша или личинки, от формирующейся эндокринной системы,в первую очередь от щитовидной железы, особенно если учесть приведенные выше данные ороли ее гормонов в ассимиляции желтка у амфибий. Нельзя исключить, что некоторые функцииЖСС нам не известны.
Очень мало данных о начале синтеза рРНК и эмбриональномнуклеологенезевядрахЖСС.Большинстворабот,посвященныхэтомуаспектуфункционирования ядер ЖСС, было выполнено на обыкновенном вьюне и некоторых другихобъектах с использованием иммуногистохимических и классических гистологических методик,а также седиментационного анализа меченых РНК (Кафиани, Костомарова 1978; Игнатьева,1979). Было бы интересно исследовать эмбриональный нуклеологенез и синтез рРНК у Teleosteiс помощью современных методик, таких как иммуногистохимия и in situ гибридизация.Проблема эмбрионального нуклеологенеза и активации синтеза рРНК входят в более широкуюпроблему активации зиготического генома и перехода развивающегося организма отиспользования материнского запаса белков, РНК, рибосом и т.д. к образованию собственных.Нет данных о том, когда прекращается полиплоидизация ядер ЖСС.Структура ЖСС изучена лишь у небольшого числа видов костистых рыб, главнымобразом, имеющих рыбохозяйственное значение.
Не исследована структура ЖСС уживородящих видов с матротрофией, для которых характерно раннее исчерпание запасов желтка,у видов с необычной формой желточного мешка, таких как Rhodeus sericeus (Aldridge, 1999; Uribeet al., 2014).Фрагментарность сведений часто не позволяет судить о значении тех или иныхособенностей ЖСС, о связи этих особенностей с условиями обитания, анатомией зародышей иличинок, в первую очередь, организацией сосудистой системы ЖМ, продолжительностьюразвития, количеством и организацией желтка, а также относительным содержанием тех илииных его компонентов.Подробное исследование ЖСС в развитии костистых рыб, принадлежащих к разнымтаксонам и отличающихся по своей биологии, в первую очередь, доступных и активноиспользуемых объектов, будет способствовать пониманию закономерностей функционированияэтой системы, онтогенетического разнообразия костистых рыб и структурно-функциональнойорганизации провизорных систем.
С учетом сказанного выше, нами было предпринятоисследование желточного комплекса представителей семи видов, принадлежащих к двум изчетырех основных групп Teleostei, отличающихся по систематическому положению, условиямобитания, организации яиц и анатомии личинок.413. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ3.1. Получение материалаОбъектами данного исследования служили зародыши и личинки костистых рыб даниорерио Danio rerio (Hamilton 1822), карпа кои Cyprinus carpio koi (Linneaus, 1758), вьюна Misgurnusfossilis (Linneaus, 1758), пеляди Coregonus peled (Gmelin, 1788), муксуна Coregonus muksun (Pallas,1814), чира Coregonus nasus (Pallas, 1776), нельмы Stenodus leucichthys nelma (Pallas, 1773) итрехиглой колюшки Gasterosteus aculeatus (Linnaeus, 1758).Работа проводилась, главным образом, на кафедре Эмбриологии Биологическогофакультета Санкт-Петербургского Государственного Университета, однако некоторые её этапыбыли выполнены в лаборатории Онтогенеза, Лаборатории Ихтиологии кафедры Ихтиологии иГидробиологии Биологического факультета СПбГУ, в ресурсных центрах СПбГУ «Хромас» и«Развитие молекулярных и клеточных технологий» (РЦ РМиКТ).Danio rerio.
Данио-рерио является широко используемым модельным объектом вразличных областях биологии. Достоинства этого объекта: короткий генеративный цикл,быстрое развитие и прозрачность зародышей, относительная неприхотливость, возможностьсодержать большое количество особей в сравнительно небольших объемах. Генетика даниорерио уже подробно изучена; применительно к этому объекту разработаны многообразныеметодические подходы и приемы.Взрослых особей данио-рерио содержали в 20-литровых аквариумах при температуре 2326°C, с постоянной фильтрацией и аэрацией (оборудование Aqua EL) и световом режиме: 13часов освещения («день»), 11 часов темноты («ночь»).
Пищу рыбки получали однократно илидважды в день. Основной корм – хлопьевидный Sera Vipan или Sera Vipagran. После последнегокормления всегда проводили чистку дна и частичное обновление воды. Для поддержаниякачества воды использовали препарат Sera Ectopur.Оплодотворенные яйцеклетки получали в результате естественного группового нереста,перед которым температуру воды поднимали до 28,5° С. Чтобы рыбы-производители не поедалиикру, их помещали в сетчатый садок, дно которого располагалось на расстоянии несколькихсантиметров от дна аквариума.
Нерест начинался вскоре после автоматического включениясвета.42Зародыши и личинки развивались в стеклянных микроаквариумах на нагревательномстолике Leica HI 1220 при температуре 28,5°С. Ход развития и состояние зародышейконтролировалось с помощью бинокулярной лупы МБС-10. Определение стадий развитияпроводили по таблицам, разработанным Киммелом и сотрудниками (Kimmel et al., 1995).Гистологическими методами было изучено 20 стадий эмбрионального развития:продолговатой бластулы (n=13), сферической бластулы (n=8), куполообразной бластулы (n=15),30%-эпиболии (n=4), 50%-эпиболии (n=11), 75%-эпиболии (n=6), 90%-эпиболии (n=10),хвостовой почки (n=16), 1–3 пар сомитов (n=11), 5–6 пар сомитов (n=7), 9–10 пар сомитов (n=17),14 пар сомитов (n=16), 18 пар сомитов (n=7), 21 пары сомитов (n=7), 26 пар сомитов (n=6), prim6 (n=9), prim 16 (n=8), prim 22 (n=8), 60 часов после оплодотворения (n=8), выступающего рта(n=8).
Личинок в возрасте 3-8 суток после оплодотворения (сут. п/о) фиксировали 3-5 раз в сутки(n=95). Было использовано 8 партий икры. Общее количество исследованных образцов - 290. Дляисследования ультраструктуры ЖСС фиксировали личинок данио-рерио в возрасте 3-6 сут. п/о(n=6).Cyprinus carpio. В преднерестовой период карпы содержались в бассейнах в ЛабораторииИхтиологии кафедры Ихтиологии и Гидробиологии Биологического факультета СПбГУ притемпературе 13-17°С. За 2-3 недели перед нерестом самцов и самок рассаживали. Рыб помещалив нерестовые бассейны с температурой воды 20°С. Затем, в течение ночи, температуру водыподнимали ещё на 3-5°С.
Нерест происходил утром на следующие сутки. Развитие шло притемпературе 23-26°С. Личинок карпа фиксировали в возрасте 4-6 сут. п/о один-два раза в сутки(n=26).Misgurnus fossilis. Икра обыкновенного вьюна была получена и зафиксированажидкостью Буэна И.В. Неклюдовой и сотрудниками на кафедре Эмбриологии Биологическогофакультета МГУ. Самцов и самок содержали раздельно в больших аквариумах в холодномпомещении.
Созревание ооцитов стимулировали при помощи инъекций хорионическогогонадотропного гормона (Костомарова, 1975). Икра развивалась при температуре 19-20° С.Материал фиксировали на стадиях: 8 (n = 8), 9 (n = 6), 9+ (n = 7), 10 (n = 6), 11 (n = 11), 14(n = 8), 16 (n = 10), 18 (n =13), 20 (n = 10), 21 (n = 5), 36 (n=3), 37 (n=3), а также через 7 сутокпосле вылупления (n = 4). Общее количество исследованных образцов – 94. Для определениястадий использовали таблицы, приведенные в книге «Объекты биологии развития»(Костомарова, 1975).43Coregonus peled, Coregonus muksun, Coregonus nasus и Stenodus leucichthys nelma.Зародышей фиксировали в жидкости Буэна, личинок – в жидкостях Буэна и Бродского.Зародыши и личинки сиговых рыб были получены в рыбоводном хозяйстве на озереСуходольском (Ленинградская область).
Икра была собрана от производителей маточных стад.Был использован материал из трех партий икры от 2013, 2015 и 2016 годов. Инкубациюпроводили в аппаратах Вейса. В 2015 году температура инкубации составляла от 0,7 до 2,8 ºС. В2013 и 2016 году основной период инкубации проходил при температуре 0,2 ºС. В 2014 годуличинок муксуна (n=10), чира (n=12) и нельмы (n=14) фиксировали дважды с интервалом в 10суток. Личинки пеляди (n=14) были зафиксированы в день вылупления и 8 суток спустя.Материал 2015-16 годов (зародыши (n=12) и личинки (n=2) муксуна) был зафиксированжидкостью Буэна.Gasterosteus aculeatus. Икра трехиглой колюшки была собрана В.В. Козиным вокрестностях МБС СПбГУ (Кандалакшский залив, Белое море) на литорали островов БольшойГорелый и Кереть в конце июня, начале июля 2015г.
Икра и личинки развивались притемпературе 10-18 ºС. Поздних зародышей (со стадии 22 (Swarup, 1958)) и личинок (n = 12)фиксировали жидкостью Буэна.3.2. Гистологическое исследованиеВ работе применяли стандартную гистологическую технику, рекомендованную вруководствах Роскина (1946) и Меркулова (1961). Материал фиксировали в жидкостях Буэна илиБродского (личинки сиговых). Объекты, зафиксированные первым способом, отмывали внескольких сменах 70° этанола (в течение недели). Материал обезвоживали в спиртахвосходящей концентрации и заливали в парапласт (Paraplast с температурой плавления 56–57°C)по стандартной схеме. Серийные срезы толщиной 5-7 μm получали при помощи санныхмикротомов LeicaSM2010R в РЦ РМиКТ и Leitz 1208.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
