Диссертация (1145769), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Б – Содержание меди(по данным ААС) и ЦП (по данным иммуноэлектрофореза) в сыворотке крови крыс в раннемпостнатальном онтогенезе (n = 3). Концентрацию ЦП вычисляли по даннымиммуноэлектрофореза как площадь области, соответствующей оксидазному ЦП. Дляпостроения калибровочной кривой использовали растворы очищенного препарата ЦП крысы сизвестными концентрациями белка.97Увеличение оксидазной и ферроксидазной активностей (Рис.
3.33) ЦПсоответствует динамике изменения содержания иммунореактивных полипептидовэтого белка, что позволяет сделать вывод, что основная часть сывороточного ЦПпредставлена холо-ЦП.Рис. 3.33. Оксидазная и ферроксидазная активности ЦП в сыворотке крови крысна раннем этапе постнатального онтогенеза (n = 3).Для определения оксидазной и ферроксидазной активностей ЦП гель посленеденатурирующего электрофореза инкубировали с орто-дианизидином или ферроцином,соответственно, после чего проводили денситометрический.Концентрация меди в сыворотке крови также повышается, что согласуется сувеличением ферментативно активного ЦП (Рис. 3.32 Б). В то же время,новорожденные крысы характеризуются почти в 2 раза более высокимотношением концентрации меди к содержанию ЦП (Рис. 3.32 Б).
Это означает,что молекула ЦП новорожденных связывает больше атомов меди и/или уноворожденных в сыворотке крови присутствует другой переносчик меди.Сывороткакровикрыс,находящихсявпериодеЭТТМ,былафракционирована методом гель-фильтрации, после чего в полученных фракцияхизмерили поглощение при 280 нм и концентрацию меди. Как видно изпредставленных данных, большая часть меди сосредоточена во фракции,содержащей высокомолекулярные компоненты (Рис. 3.34). По результатамопределения оксидазной активности, эта фракция соответствует пику белка ЦП.98Рис.
3.34. Гель-фильтрация сыворотки крови крысы, 6-ой день жизни.* фракции, характеризующиеся оксидазной активностью.На следующем этапе из сывороток крови 6-ти дневных и взрослых крысиммунопреципитировалифракциюЦП.Определениеконцентрациимедипоказало, что основная часть сывороточной меди ассоциирована с ЦП, причем каку крыс в период ЭТТМ, так и у взрослых крыс (Рис. 3.35).Рис.
3.35. Содержание меди в сыворотке крови и во фракции ЦП новорожденныхи взрослых крыс (n = 3).Как видно на хроматограмме, концентрация меди в низкомолекулярнойобласти (около 10 кДа) лишь немного превышает фоновое значение. Ранее было99показано, что белок МТ обнаруживается в сыворотке крови взрослыхмлекопитающих, вне клетки он выполняет функцию транспортера металлов,участвует в перераспределении тяжелых металлов в организме (Lynes et al., 2006).В рамках настоящего исследования показано присутствие МТ в сыворотке кровикрыс (Рис.
3.36 А). Кроме того, была проведена оценка количества меди,связаннойсМТвсыворотке кровикрыс.ДляэтогофракциюМТиммунопреципитировали из сыворотки специфическими антителами. Оказалось,что около 1% от общего количества сывороточной меди новорожденных связано сбелком МТ, но после переключения на ВТТМ эта величина снижается в 2 раза(Рис. 3.36 Б). Вероятно, основная часть меди в кровотоке новорожденных крыссвязана с ЦП. Это предположение подтверждается опубликованными ранееданными, показавшими, что молекула ЦП новорожденных детей и телят включаетбольше атомов меди, чем молекула ЦП взрослого; эти “добавочные” атомы медилегко теряют связь с молекулой ЦП при обработке хелатирующим агентомХелекс-100 (Okumura et al., 1998; Жигулева и др., 1999).Рис.
3.36. Содержание полипептидов МТ (А) и концентрация меди и цинка вофракции МТ (Б) в сыворотке крови новорожденных и взрослых крыс.А – содержание полипептидов МТ было определено методом иммуноблотинга (n = 4). Б –концентрация металлов была определена во фракциях, иммунопреципитированных изсыворотки крови антителами к белку МТ (n = 2). По оси ординат отложен процент от общейконцентрации металла в сыворотке крови.* p < 0.05.100Помимо меди, МТ связывает атомы цинка, поэтому в иммунопреципитатахтакже была измерена концентрация цинка. Было показано, что у новорожденныхкрыс с МТ связано почти 8% общего количества цинка, в то время как у взрослыхкрыс этот показатель снижается в 4 раза (Рис. 3.36 Б).
Общая концентрация цинкав сыворотке крови крыс снижается в 2 раза при переходе к ВТТМ (Рис. 3.37).Рис. 3.37. Концентрация цинка в сыворотке новорожденных и взрослых крыс(n = 3).Снижение содержания цинка в сыворотке крови крыс в течение онтогенезаранее в литературе описано не было, однако эти результаты согласуются сданными, показывающими, что концентрация цинка в сыворотке крови человекауменьшается вдвое к 8-ой неделе жизни (Airede, 1997).3.2.3. Изменение профилей экспрессии генов, ассоциированных сметаболизмом меди, в течение онтогенезаАнализ экспрессии генов, кодирующих белки МСМ, проводили методомполуколичественной ОТ-ПЦР.
Для данного исследования были сформированыследующие группы крыс: 3-дневные крысы, характеризующиеся раннимпостнатальным периодом ЭТММ (медь накапливается в ядрах), 12-дневныекрысы, поздний срок ЭТММ (медь аккумулируется в митохондриях), и взрослые60-дневные крысы, в печени которых метаболизм меди соответствует взрослому101типу.
В рамках данной работы была проведена оценка уровня экспрессии генов,кодирующих основные белки, ассоциированные с метаболизмом меди. Их списоки краткая характеристика приведены выше.Экспрессия генов, кодирующих белки МСМ, в печени крыс на разных этапахонтогенезаРезультатыОТ-ПЦРанализа,показывающиеизменениепрофилейактивностей генов, ассоциированных с метаболизмом меди, в печени крыс наразных этапах онтогенетического развития, представлены на рисунке 3.38. Каквидно из приведенных данных, в течение онтогенеза в печени крыс происходитувеличение экспрессии гена Cp.
В печени 3-дневных крыс обнаруживается лишьследовое количество мРНК, кодирующей заякоренную в мембране сплайсизоформу ГФИ-ЦП, однако к 12-му дню жизни содержание данной мРНКначинает увеличиваться. Ранее было показано, что мРНК, кодирующая ГФИ-ЦП,не экспрессируется в культивируемых гепатоцитах линии HepG2 (Клотченко идр., 2008). Возможно, данная мРНК синтезируется в печени клеткаминегепатоцитарного ряда (например, Купферовскими клетками), и доля этихклеток в печени увеличивается в течение развития.У взрослых крыс активность гена Ccs многократно превосходит активностьэтого гена в клетках 3-дневных крыс (Рис. 3.38 Б). Повышение активностиначинается еще в период ЭТММ (Рис. 3.38 А).
Увеличение экспрессии геновSod1, Sod2 и Cox4i1 также начинается до 12-го дня жизни (Рис. 3.38 А) ипродолжается после смены ЭТММ (Рис. 3.38 Б).В печени взрослых крыс увеличивается содержание CTR2-мРНК, а такжемногократноповышаетсясодержаниеCTR1-мРНК,причемизмененияначинаются уже после переключения на ВТММ (Рис. 3.38 Б).
Также, экспрессиягена Mt1a снижается почти вдвое после 12-го дня жизни.Из двух генов, кодирующих медь-транспортные АТФазы, в печениноворожденных крыс активно экспрессируется Atp7a (Рис. 3.38 А). ПослепереключениянаВТТМэкспрессиягенаAtp7aподавляется,иего102транскрипционный продукт больше не обнаруживается в печени взрослых крыс.В то же время, экспрессия гена Atp7b возрастает (Рис. 3.38 Б).Рис. 3.38. Экспрессия генов, ассоциированных с метаболизмом меди, в печеникрыс на разных этапах онтогенеза (n = 3).А – профили экспрессии генов, ассоциированных с метаболизмом меди, в печени 3- и 12дневных крыс, характеризующихся ЭТММ.
Б – сравнение профилей экспрессии генов,ассоциированных с метаболизмом меди, в печени 3-дневных (ЭТММ) и 60-дневных (ВТММ)крыс. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.005.Низкая активность гена Atp7b согласуется с полученными в настоящемисследовании данными о содержании меди в сыворотке и печени новорожденных103крыс, а также с результатами, описанными в литературе. Ранее было показано, чтоу новорожденных детей наблюдается физиологическая недостаточность меди всыворотке крови в сочетании с высокой ее концентрацией в печени (Bruckmannand Zondek, 1939; Srai et al., 1986).
Схожая картина распределения меди,предшествующая появлению цирроза и признаков нейродегенерации, былаописана для пациентов с болезнью Вильсона (Srai et al., 1986; Lutsenko et al.,2007). Данное состояние развивается в результате низкой активности гена Atp7b,что характерно для новорожденных при ЭТТМ, либо в случае наличия мутации вданном гене, как у пациентов с болезнью Вильсона (Huster et al., 2006).
Уноворожденных детей, а также у пациентов с прогрессирующей болезньюВильсона методом электронной микроскопии медь была обнаружена в лизосомах(Goldfischer and Sternlieb, 1968; Goldfischer et al., 1980). Однако результатынастоящего исследования свидетельствуют о том, что накопление меди в первыедни после рождения начинается в ядре, после чего основной пул медиперемещается в митохондрии, в то время как небольшие порции медилокализуются в цитозоле и фракции внутриклеточных мембран (Рис. 3.30).Возникшее противоречие может быть объяснено использованием различныхэкспериментальных подходов. Так, в настоящем исследовании было проведеноразделениемитохондриальнойилизосомальнойфракций,послечегоконцентрация меди была измерена при помощи ААС, в то время как прииспользованииэлектронноймикроскопииопределениесодержаниямедипроводилось путем специфического окрашивания срезов печени.
Данныенастоящего исследования согласуются с результатами недавно опубликованныхработ, в которых рассматривается распределение меди в печени нокаутныхмышей Atp7b-/- и крыс линии LEC (имеющих мутацию в гене Atp7b). Былопоказано, что накопление меди в печени этих животных начинается в ядре ипродолжается в митохондриях (Huster et al., 2006; Zischka et al., 2011).В данном исследовании, помимо хорошо известных изменений экспрессиигенов Cp, Atp7a и Atp7b в печени при переключении ЭТТМ на ВТТМ (Hurley etal., 1980; Bingle et al., 1991; Lutsenko et al., 2007), были также впервые показаны104изменения активности генов Ctr1, Ctr2, Ccs и Mt (Рис. 3.38).
Так, экспрессия генаCtr1 в печени 3-дневных и 12-дневных крыс происходит на низком уровне, почтив 5 раз ниже, чем активность гена Ctr2. Количество мРНК, кодирующей белокCTR1, у взрослых крыс почти в 10 раз больше, чем у новорожденных крыс. И,несмотря на то, что активность гена Ctr2 возрастает после смены типаметаболизма меди, значение отношения CTR1-мРНК/CTR2-мРНК увеличиваетсязначительно.Соответствия между экспрессией генов Sod1 и Ccs в печени 3-дневных крысобнаружено не было: при активной экспрессии гена Sod1, относительноесодержание CCS-мРНК остается очень низким.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
