Диссертация (1145769), страница 17
Текст из файла (страница 17)
К 12-дневному возрасту у крысначинается повышение активности гена Sod1, у взрослых крыс содержание СОД1мРНК приблизительно на 30%, чем у 3-дневных. В то же время, экспрессия генаCcs возрастает почти в 10 раз. Активность гена Sod2 повышается в течениеонтогенеза (Рис. 3.38).Было показано, что в печени крыс в течение ЭТММ экспрессия гена Mt1aсохраняется на довольно высоком уровне, но после переключения на ВТТМпроисходит двукратное снижение активности данного гена (Рис. 3.38). В то жевремя, экспрессия гена Commd1 в течение онтогенетического развития неизменяется.СодержаниеCOX4i1-мРНКувеличиваетсяприсменетипаметаболизма меди.
Как и ожидалось, в печени крыс не происходило экспрессиигена Pam. Представленные результаты также показывают, что перераспределениемеди из ядер в митохондрии не связано с изменением активности исследованныхгенов.Экспрессия генов, кодирующих белки МСМ, в надпочечниках крыс на разныхэтапах онтогенезаВ отличие от печени, в клетках надпочечников крыс в течение всегоонтогенеза не обнаруживаются мРНК секреторного ЦП и ATP7B (Рис. 3.39). В тоже время, мРНК изоформы ГФИ-ЦП и ATP7A присутствуют от рождения и увзрослых крыс их содержание увеличивается.105Рис.
3.39. Экспрессия генов, ассоциированных с метаболизмом меди, внадпочечниках крыс на разных этапах онтогенеза (n = 3).А – профили экспрессии генов, ассоциированных с метаболизмом меди, в надпочечниках 3- и12-дневных крыс, характеризующихся ЭТММ. Б – сравнение профилей экспрессии генов,ассоциированных с метаболизмом меди, в надпочечниках 3-дневных (ЭТММ) и 60-дневных(ВТММ) крыс. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.005.Для того чтобы убедиться в отсутствии мРНК секреторного ЦП,использовали пару праймеров Cp(2-4), при помощи которой обнаруживаются обеизоформы ЦП.
Как видно из представленных данных, содержание ЦП-мРНКсовпадает по результатам анализа с использованием праймеров ГФИ-Cp либо106Cp(2-4). Полученный результат позволяет считать, что секреторный ЦП необразуется в надпочечниках.В надпочечниках активность гена Ctr1 выше у новорожденных крыс, онаначинает снижаться перед сменой типа метаболизма меди и у взрослых крыспочти на 20% ниже, чем у 3-дневных. Ген Ctr2 экспрессируется на постоянномуровне и этот уровень примерно в 2 раза ниже, чем активность гена Ctr1.В надпочечниках гены Sod1 и Ccs экспрессируются на близком уровне и ихактивностьнеменяетсявтечениеонтогенеза(Рис.3.39).ГенSod2экспрессируется в надпочечниках на постоянном уровне.В надпочечниках взрослых крыс ген Mt1a активнее, чем у 3-дневных и 12дневных крыс.
Количество мРНК, кодирующей белок COMMD1, снижается уже кмоменту переключения на ВТТМ. Активность гена Cox4i1 не меняется свозрастом. В отличие от печени, в надпочечниках наблюдалась активнаяэкспрессия гена Pam, которая уменьшается у взрослых крыс.Экспрессия генов, ассоциированных с метаболизмом железа, в печени инадпочечниках крыс на разных этапах онтогенезаВ печени и надпочечниках крыс указанных возрастных групп были такжеопределены профили экспрессии генов, кодирующих белки, ассоциированные собменом железа. Результаты ОТ-ПЦР анализа представлены на рисунках 3.40 и3.41. Они показывают, что гены Fth1 и Ftl, кодирующие тяжелую и легкую цепиферритина,атакжегенTfrc,кодирующийрецептортрансферрина,экспрессируются более активно в печени взрослых крыс, в то время какэкспрессия гена трансферринане зависитотвозраста(Рис.3.40).
Уноворожденных крыс прослеживается связь между транспортом железа в печении низким уровнем ЦП в сыворотке крови, осуществляющим окисление Fe(II) вFe(III), необходимое для формирования холо-трансферрина. Она, возможно,состоит в повышении уровня мРНК рецептора трансферрина (Рис. 3.40).107Рис. 3.40.
Экспрессия генов, ассоциированных с метаболизмом железа,в печени крыс в течение онтогенеза (n = 3).А – профили экспрессии генов, ассоциированных с метаболизмом железа, в печени 3- и 12дневных крыс, характеризующихся ЭТММ. Б – сравнение профилей экспрессии генов,ассоциированных с метаболизмом железа, в печени 3-дневных (ЭТММ) и 60-дневных (ВТММ)крыс. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.005.Рис. 3.41. Экспрессия генов, ассоциированных с метаболизмом железа,в надпочечниках крыс в течение онтогенеза (n = 3).А – профили экспрессии генов, ассоциированных с метаболизмом железа, в надпочечниках 3- и12-дневных крыс, характеризующихся ЭТММ.
Б – сравнение профилей экспрессии генов,ассоциированных с метаболизмом железа, в надпочечниках 3-дневных (ЭТММ) и 60-дневных(ВТММ) крыс. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.005.В надпочечниках онтогенез-зависимый характер экспрессии проявляютгены, кодирующие легкую цепь ферритина и трансферрин (возможно, изоформаГФИ-трансферрин). Экспрессия гена рецептора трансферрина увеличивается внадпочечниках 12-дневных крыс, но возвращается на прежний уровень увзрослых животных.1083.2.4. Содержание белков, участвующих в метаболизме меди, в печени инадпочечниках крыс в течение раннего онтогенезаСодержание полипептидов белков, ассоциированных с метаболизмом меди,оценивали по результатам иммуноблотинга со специфическими антителами.Субклеточные фракции цитозоля и митохондрий получали из гомогенатов печениили надпочечников крыс методом дифференциального центрифугирования.
Припомощи специфических антител митохондриальный белок COX4, а такжецитозольные белки МТ, COMMD1 и СОД1 были выявлены в соответствующихсубклеточных фракциях. Относительное содержание белков во фракцияхопределяли денситометрически (Рис. 3.42).Рис. 3.42. Содержание белков, связанных с метаболизмом меди, в надпочечникахи печени крыс в течение онтогенеза (n = 3).А – иммуноблотинг фракций цитозоля и митохондрий с антителами к МТ, COMMD1, COX4 иСОД1.
Б и В – денситометрический анализ данных иммуноблотинга во фракциях, выделенныхиз печени (Б) и надпочечников (В) крыс.* p < 0.05.109Видно, что относительная концентрация полипептидов МТ и COMMD1 внадпочечниках выше у взрослых крыс. В печени содержание этих белков неменяется в течение онтогенетического развития. По результатам анализа былаотмечена частичная корреляция между содержанием зрелых полипептидов MT иCOMMD1 и уровнем их мРНК. Так, в надпочечниках содержание полипептидовMT увеличивается в течение развития, как и концентрация МТ-мРНК. В то жевремя, увеличение концентрации полипептидов COMMD1 происходит, несмотряна снижение активности гена, кодирующего данный белок.В печени уровни концентрации МТ и COMMD1 не изменяются припереключении типа метаболизма меди, хотя содержание МТ-мРНК у взрослыхживотных снижается почти в 2 раза по сравнению с новорожденными крысами.Стоит отметить, что рассогласование между транскриптомом и протеомомхарактерно для многофункциональных белков, имеющих сложную системурегуляции экспрессии на уровне транскрипции и/или трансляции.
Оба белка МТ иCOMMD1 являются многофункциональными (de Bie et al., 2005; Vasak andMeloni, 2011).Содержание белков COX4 и СОД1 не изменяется в надпочечниках крыс, вто время как в печени смена типов метаболизма меди сопровождаетсяувеличением концентрации полипептидов этих белков.Помимо определения содержания зрелых полипептидов белка СОД1, вцитозоле печени и надпочечников оценивали также уровень его ферментативнойактивности (Рис. 3.43).КакпоказываютрезультатыОТ-ПЦРанализа,иммуноблотингаиферментативного теста (Рис. 3.38; 3.42; 3.43), содержание мРНК, кодирующейСОД1, ее трансляционного продукта, а также активной формы фермента холоСОД1 полностью соответствуют друг другу, а также согласуются с даннымилитературы, показывающими увеличение экспрессии СОД1 в клетках печени втечение развития (de Haan et al., 1994).Выше отмечено, что мРНК, кодирующая белок CCS, обнаруживается впечени новорожденных крыс в следовых количествах (Рис.
3.38). Недавно было110показано, что для металлирования СОД1 необходимо, чтобы комплекс CCS/СОД1был связан с липидным бислоем, кроме того, CCS должен взаимодействовать сбелком CTR1 (Pope et al., 2013). Возможно, в течение ЭТТМ металлирование апоСОД1 осуществляется при помощи иного механизма, не зависящего от CCS, идоставку меди к СОД1 осуществляет глутатион, получивший медь от белка МТ(Carroll et al., 2004).Рис.
3.43. Ферментативная активность СОД1 в печени и надпочечникахноворожденных и взрослых крыс (n = 3).Сверху: ПААГ, окрашивание нитротетразолием синим, выявляющее ферментативнуюактивность СОД1.* p < 0.05.Данное предположение подтверждается тем, что в период ЭТТМ в печеникрысобнаруживаетсявысокоесодержаниеМТ1а-мРНК,кодирующейспецифическую изоформу белка МТ, вовлеченную в гомеостаз меди.
В печенивзрослых крыс происходит снижение активности гена Mt1a, в то время какэкспрессия Ccs резко возрастает. Это означает, что после переключения на ВТТМапо-СОД1 начинает получать медь от Cu(I)-CCS.1113.2.5. Схемы метаболизма меди в гепатоцитах в надпочечниках крысДанные о низком уровне экспрессии гена Ctr1 в печени новорожденныхкрыс на фоне аккумулирования меди (Рис. 3.38), хорошо согласуются срезультатами недавнего исследования, in vitro показавшего, что общийтранскрипционныйфакторSp1являетсямедь-управляемыммодуляторомэкспрессии гена Ctr1, а активность самого гена Sp1 подавляется высоким уровнемвнутриклеточной меди (Liang et al., 2012). Ранее в нашей лаборатории былопоказано, что содержание белка Sp1 в ядре находится на очень низком уровне впечени новорожденных, но не взрослых крыс (Рис.
3.44) (Гюлиханданова и др.,2004).Рис. 3.44. Содержание транскрипционного фактора Sp1 в нуклеоплазмелактирующей молочной железы (1), в печени 10-дневных (2) и взрослых крыс (3).Присутствие Sp1 регистрировали методом иммуноблотинга с моноклональными антителами кSp1 в экстрактах ядер, изолированных методом равновесного центрифугирования. В лункупомещали по 50 мкг белка экстракта (Гюлиханданова и др., 2004).Вероятно, CTR1 не играет важной роли в импорте меди в гепатоцитыноворожденных, поскольку основным источником пищевой меди на этом этапеявляется ЦП молока, синтезируемый в клетках молочной железы крысы–матери исекретируемый в молоко (Пучкова и др., 1994; Cerveza et al., 2000).
Основнаячасть меди в снятом молоке находится в составе ЦП (Platonova et al., 2007). Онпереносится из пищеварительного тракта в кровоток новорожденных путемтрансцитоза с участием рецептора ЦП (Platonova et al., 2007; Chu et al., 2012).После этого клетки печени эндоцитируют молочный ЦП также при помощиспецифического рецептора. Ген рецептора церулоплазмина экспрессируется вгепатоцитах и клетках слизистой оболочки кишечника только у новорожденныхживотных. Активность этого гена подавлена у взрослых (Kataoka and Tavassoli,1984; Crowe and Morgan, 1996; Платонова и др., 2004; Платонова и др., 2005;112Platonova, et al., 2007). Следует отметить, что ЦП молока как источник пищевоймеди адаптирован к ЭТММ. Его молекула содержит больше атомов меди, чемхоло-ЦП сыворотки крови (Пучкова и др., 1997), а по сравнению с солями медиили комплексом меди с гистидином, лучше усваивается органами эмбрионакрысы (Lee, et al., 1993).
Представленные данные позволяют рассматривать ЦПмолока как физиологический источник меди для новорожденных, а рецептор ЦПи ЦП молока – партнерами в транспорте меди в организме новорожденного.Таким образом, путем эндоцитоза нагруженного медью молочного ЦП впечени новорожденных пищевая медь попадает в лизосомы, где при низкихзначениях pH медь выходит из состава молекулы ЦП и при помощи Fe/Cuредуктазы STEAP4 восстанавливается до состояния окисления Cu(I) (Knutson,2007).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
