Диссертация (1145769), страница 14
Текст из файла (страница 14)
3.20 А).Рис. 3.20. Схема сбора фракций (А) и содержание мтДНК (Б) во фракцияхмитохондрий печени контрольной крысы.1 – 10 номера фракций, отобранных из градиента сахарозы, начиная с верхней.В полученных фракциях методом ПЦР определили присутствие мтДНК.Ожидали, что мтДНК будет обнаруживаться лишь в средних фракциях,81соответствующих видимой зоне в градиенте сахарозы. Но результаты анализапоказали, что мтДНК содержится во всех отобранных фракциях (Рис. 3.20 Б).Результат предварительного эксперимента подтвердил, что необходимопровести более тщательный анализ митохондриальной популяции печениконтрольной крысы.3.1.5.
Влияние АЭ на гетерогенность популяции митохондрий печени крысВ отсутствие сведений о существовании субпопуляций митохондрийвообще и влиянии АЭ на митохондрии печени в частности, мы выбралиследующий подход. Методом дифференциального центрифугирования гомогенатпечени ЛО и АЭ крыс был разделен на грубую ядерную фракцию и грубуюмитохондриальную фракцию. Ядерная фракция была ресуспендирована в ГБ инанесена на 2-ступенчатый градиент сахарозы (42–45%), после чего градиент былподвергнут центрифугированию в течение 1 часа при 36000×g.
Зона на границе42-45% концентраций сахарозы была собрана в две фракции объемом по 1 мл: Я1иЯ2,соответственно“легкая”и“тяжелая”фракциимитохондрий,седиментирующих с ядрами. Грубая фракция митохондрий была такжересуспендирована в ГБ, после чего фракционирована в ступенчатом градиентесахарозы (27–41–42–43–44–45–47–50%) в течение 5 часов при 58000×g.Результаты фракционирования представлены на рисунке 3.21.Видно, что грубая митохондриальная фракция состоит из митохондрий сразличной плотностью и распределяется от 41% до 45% сахарозы.
По 12 фракцийобъемом 1 мл было собрано в этом диапазоне сахарозы из каждого градиентасахарозы: фракции 1 – 12 (Ф1 – Ф12). Каждая полученная фракция быларазведенав2разабуферомГБ,послечегомитохондриисобралицентрифугированием и осадок ресуспендировали в одинаковом объеме ГБ (50мкл).82Рис. 3.21. Распределение митохондрий печени ЛО и АЭ крыс в ступенчатомградиенте сахарозы (А) и схемы отбора фракций (Б).1, 2 – градиент сахарозы с пробами фракций Я1 – Я2; 3, 4 – ступенчатый градиент сахарозы спробами фракции Ф1 – Ф12.
1, 3 – печень ЛО крысы; 2, 4 – печень АЭ крысы.5 – схема отбора фракций Я1 –Я2, 6 – схема отбора фракций Ф1 – Ф12.Концентрациябелкабылаопределенавкаждойпробеспектрофотометрически по методу Бредфорд. Распределение по белку вофракциях митохондрий Ф1 – Ф12 представлено на рисунке 3.22.Рис. 3.22. Распределение белка в митохондриальных фракциях Ф1 – Ф12.По оси абсцисс – номер фракции, начиная от 41% сахарозы.Видно, что у АЭ животных существенно меньше содержание митохондрийнизкойплотности.Обращаетнасебявнимание,чтовофракции83низкоседиментирующих митохондрий тотальное содержание белка у ЛОживотных почти в 2 раза выше, чем у АЭ крыс.
“Легкая” и “тяжелая” фракцииседиментирующих с ядрами митохондрий у ЛО животных представленыпримерно в одинаковом количестве (Рис. 3.23). В то же время, у АЭ крыс “легкая”фракция превалирует над “тяжелой”.Рис. 3.23. Количественный анализ популяции митохондрий, ассоциированной сядрами.Все полученные фракции митохондрий были проанализированы методомиммуноблотинга с антителами к COX4 (рис. 3.24).Рис. 3.24. Иммуноблотинг фракций митохондрий с антителами к COX4.ВэтихжефракцияхбылапроведенапрямаяреакцияПЦРсоспецифическими праймерами к мтДНК крысы. На рисунке 3.25 представленырезультаты этого эксперимента.84Результатыпоказали,чтонекотороеколичествомитохондрийобнаруживается во фракции, седиментирующей при 800×g и состоящей восновном из ядер и крупных фрагментов клеточных мембран.Рис.
3.25. Распределение мтДНК во фракциях митохондрий.М – маркер.Следует полагать, что митохондрии фракций Я1 и Я2 отличаются по своимморфологическим характеристикам от митохондрий, принадлежащих фракциямФ1 – Ф12. Они могут иметь более крупные размеры, либо образовывать междусобой комплексы, что позволяет им седиментировать при более низкой скоростицентрифугирования.На основе полученных данных о содержании мтДНК и белка COX4,компонента дыхательной цепи митохондрий, было определено отношениемтДНК/COX4 для исследуемых фракций (Рис. 3.26).Анализ показывает, что митохондрии печени АЭ крыс, ассоциированные сядрами,обедненымтДНК.Результатынастоящегоисследованиясвидетельствуют, что удаление надпочечников приводит к изменениям всоотношении митохондриальных субпопуляций печени, в частности, происходитснижение размеров субпопуляции митохондрий, седиментирующей с ядрами.85Рис. 3.26.
Соотношение мтДНК/COX4 в анализируемых фракциях митохондрий.На основании представленных данных можно сделать вывод, что, следуястандартному протоколу получения митохондрий методом дифференциальногоцентрифугирования как фракции, седиментирующей при 12000×g, следуетучитывать, что специфическая часть митохондриальной популяции, остается зарамками анализа. Полученные в данном разделе результаты являются заделом длядальнейшегоисследования.Представляетсяважнымразработатьметод,позволяющий выделить все субпопуляции митохондрий и дать им подробнуюхарактеристику.3.1.6. Исследование транскрипционной активности генов, кодирующих белкиМСМ, в печени АЭ крысНадпочечники способны регулировать работу других органов путемсекреции медиаторов и гормонов в кровоток.
Так, мозговая зона надпочечниковпродуцирует катехоламины, которые секретируются в кровоток и регулируютработудругихоргановчерезвзаимодействиессоответствующимиадренергическими рецепторами, связанными с G-белком и действующими черезаденилат-циклазы,продуцирующимисAMP,способнуюмодулироватьэкспрессию генов, содержащих CRE последовательность (cyclic-AMP responsiveelement) в промоторной области (Milde et al., 2014). Помимо катехоламинов,продуктомэндокриннойфункциикорынадпочечниковявляютсятакже86глюкокортикоидные и минералокортикоидные гормоны.
Из этих двух подклассовстероидныхгормоновглюкокортикоиды,связываясьсоспецифическимирастворимыми ядерными рецепторами, изменяют активность генов (Mangelsdorfet al., 1995), содержащих в промоторной области цис-элементы, называемые GRE(glucocorticoid-responsive element) (Freedman, 1992). Для того чтобы установить,контролируются ли гены МСМ гормонами надпочечников, был проведенбиоинформатический поиск CRE и GRE последовательностей в промоторныхобластях генов крысы, кодирующих белки, вовлеченные в метаболизм меди.Поискцис-элементов,регулируемыхгормонаминадпочечников,впромоторных областях генов, кодирующих белки МСМВ рассмотрение взяли гены, кодирующие белки следующих групп:транспортеры меди, купроэнзимы и белки, участвующие в депонировании меди вклетке.Первую группу составили гены, кодирующие медь-транспортные белки:Ctr1, кодирующий высокоаффинный универсальный импортер Cu(I),который осуществляет транспорт меди в клетки всех типов;Ctr2, кодирующий низкоаффинный транспортер меди, сходный поструктуре с CTR1.
Когда CTR2 локализован на плазматической мембране, онимпортирует Cu(I) в цитозоль, а будучи локализованным в лизосомах участвует вмобилизации меди из вакуолей, возможно, обеспечивая рециклизацию меди приее дефиците;Atp7aиAtp7b,геныдвухCu(I)-транспортныхАТФазР1типа,локализованных в мембранах аппарата Гольджи, участвующих во встраиваниимеди в секреторные белки и в экскреции меди;Ccs, ген Cu(I)-шаперона для СОД1, белковый продукт которого принимаетатом меди из сайта на C-конце медь-транспортного белка CTR1 и встраивает вактивный центр СОД1.Гены второй группы кодируют купроэнзимы:87Cp, ген, продуктами которого являются главный секреторный ЦП, а такжеего сплайс-изоформа ГФИ-ЦП – белок, заякоренный в мембрану с помощьюгликозилфосфатидилинозитолового якоря. Секреторный ЦП сочетает в себефункции медь-транспортного белка, осуществляющего доставку ионов меди кклеткам негепатоцитарных рядов, и купроэнзима.
ГФИ-ЦП участвует вмобилизации железа из клеток и проявляет антиоксидантную активность. Парыпраймеров были подобраны таким образом, что позволяли селективно определятьмРНК секреторной и заякоренной изоформ ЦП, а также пара праймеров Cp(2-4)позволяла выявлять одновременно мРНК обеих форм белка;Sod1, ген, кодирующий убиквитический купроэнзим эукариотов Cu/Znсупероксиддисмутазу (СОД1), участвующий в системе детоксикации активныхрадикалов в цитозоле всех типов клеток. В качестве сравнения была такжеоцененаэкспрессиягенаSod2,кодирующегомитохондриальнуюмедь-независимую Mn-СОД;Cox4i1, ген изоформы 1 субъединицы IV ЦО, медь-связывающего белка,являющегося терминальным звеном цепи переноса электронов в митохондриях.Выбор субъединицы IV обусловлен тем, что гены, кодирующие I, II и IIIсубъединицы комплекса ЦО расположены на митохондриальной ДНК, в то времякак ген IV субъединицы имеет ядерное происхождение и содержит интроны, чтопозволяет подобрать специфические праймеры для проведения ОТ-ПЦР реакции.Кроме того, экспрессия данного гена строго коррелирует со сборкой ифункционированием целого комплекса ЦО, поэтому по уровню активности этогогена можно судить об активности всей ЦО;Pam,генпептидилглицинα-амидирующеймонооксигеназы,специфического купроэнзима нейроэндокринной системы и надпочечников,катализирует α-амидирование нейропептидов и пептидных гормонов.Третьюгруппу составилигены,продуктыкоторыхподдерживаютвнутриклеточный гомеостаз меди:Mt1a, ген металлотионеина 1а, белка, связывающего на 1 молекулупримерно 6 – 8 атомов Cu(I).
Эти атомы меди могут освобождаться глутатионом88(при этом восстанавливаться до Cu(II)) и поступать в купроэнзимы илисвязываться белком COMMD1.Commd1, кодирующий цитозольный белок, мутации в котором приводят кнакоплению меди в клетке. COMMD1 координирует медь в состоянии окисленияCu(II) и, помимо выведения меди участвует в различных клеточных процессах, втом числе и в сигналинге.Поиск цис-элементов осуществляли на расстоянии 3000 п. н. upstream от +1нуклеотида. Для поиска CRE использовали каноническую палиндромную 8нуклеотидную CRE последовательность TGACGTCA (Montminy et al., 1986).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
