Диссертация (1145769), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Далее медь взаимодействует с медь-связывающими мотивами белка CTR2,который принимает участие в лизосомальном обороте меди (Rees et al., 2004) ипереносит медь из лизосомы в цитозоль, где медь распределяется в соответствии спотребностями в ней клетки. Модель предположительного пути обмена меди,включающего участие CTR2, объясняет существующую диспропорцию междууровнями экспрессии генов Ctr1 и Ctr2 в клетках печени новорожденных крыс(Рис. 3.45).Возможно, что в печени взрослых млекопитающих CTR2 участвует врециклизации меди, связанной с асиаловым ЦП, который из кровотокаутилизируется рецептором асиалогликопротеинов (Gregoriadis et al., 1970).
В тоже время, основной путь импорта меди в клетки печени взрослых крысосуществляется через белок CTR1, что согласуется с резким повышением уровняэкспрессии гена Ctr1 после снижения содержания меди в печени и активации генаSp1. В отличие от гепатоцитов новорожденных крыс, в печени взрослыхживотных доставку меди к цитозольному купроэнзиму СОД1 осуществляетшаперон CCS, экспрессия гена Ccs резко возрастает при переходе на ВТММ.Схематическое представление обмена меди в гепатоцитах взрослых крыс дано нарисунке 3.46.113Рис. 3.45. Схема метаболизма меди в гепатоцитах новорожденных крыс.Я – ядро, ЭПР – эндоплазматический ретикулум, цАГ – цис-сеть аппарата Гольджи, тАГ –транс-сеть аппарата Гольджи, ЭЛ – эндолизосома.Рис.
3.46. Схема метаболизма меди в гепатоцитах взрослых крыс.Я – ядро, ЭПР – эндоплазматический ретикулум, цАГ – цис-сеть аппарата Гольджи, тАГ –транс-сеть аппарата Гольджи, ЭЛ – эндолизосома.114В надпочечниках система метаболизма меди имеет много схожего склетками негепатоцитарных рядов. Так, в клетках надпочечников из двух Cu(I)АТФаз экспрессируется только ген Atp7a.
Это характерно для большинстваклеток всех органов новорожденных и взрослых млекопитающих за исключениемгепатоцитов и клеток некоторых отделов мозга (Платонова и др., 2005;Клотченко и др.,2008).Известно,что ATP7Aпринимаетучастие вметаллировании купроэнзимов, формирующихся в аппарате Гольджи (Polishchukand Lutsenko, 2013). В настоящем исследовании были оценены уровни экспрессиигенов Cp и Pam, кодирующих купроэнзимы, формирующиеся в секреторном пути.Ген Cp активен в надпочечниках, но формируется только сплайс-форма мРНК,кодирующая белок ГФИ-ЦП. Активность гена Cp растет в течение развития.
Ген,кодирующий белок PAM, экспрессируется активно, но уровень PAM-мРНКснижается на 30% в течение развития. Возможно, последнее происходитвследствие созревания гипоталамо–гипофизарно–надпочечниковой системы иуменьшения продукции нейропептидов клетками надпочечников. Молекула ГФИЦП содержит 6 – 8 атомов меди, в то время как молекула PAM содержит только 2атома, поэтому можно сказать, что усиление экспрессии гена Atp7a согласуется сповышением потребности в меди. Возможно, медь, ассоциированная с ГФИ-ЦП иPAM, может быть рециклизирована путем эндоцитоза или макроаутофагии черезлизосомальную систему STEAP4/CTR2 (Рис.
3.47).Присутствие МТ в сыворотке новорожденных крыс описано впервые (Рис.3.36). Этот белок был нагружен медью и цинком, но связывание смикроэлементами могло происходить только внутри клеток, иначе апо-МТ былбы немедленно окислен во внеклеточном пространстве. Происхождение МТ,механизм доставки этого типичного белка цитозоля в кровоток, а также егофизиологическаяпредположить,рольчтоутребуютдальнейшегоноворожденныхМТисследования.печениможетМожноигратьрольмежорганного переносчика микроэлементов и служить донором меди для клетокнадпочечников, а после переключения с ЭТТМ на ВТТМ данная функция МТ115теряется и наблюдается снижение уровня мРНК данного белка в печени (Рис.3.38).Рис.
3.47. Схема метаболизма меди в надпочечниках взрослых крыс.Я – ядро, ЭПР – эндоплазматический ретикулум, цАГ – цис-сеть аппарата Гольджи, тАГ –транс-сеть аппарата Гольджи, ЭЛ – эндолизосома.Однако нельзя исключить, что донором меди для клеток надпочечников уноворожденных может являться сывороточный ЦП, в составе которого находятсялабильные атомы меди. Для того чтобы понять роль МТ в поддержаниимежорганного баланса меди, а также идентифицировать донора меди для клетокнадпочечников, необходимы дополнительные исследования.1164.
ЗАКЛЮЧЕНИЕНастоящее исследование состоит из двух частей. В первой части изученовлияние АЭ на метаболизм меди в печени крыс. Во второй части сопоставленыизменения метаболизма меди в печени и надпочечниках в течение онтогенеза.ПеченьмлекопитающихсекретируетвкровотокЦП,являющийсяодновременно медь-транспортным белком, обеспечивающим медью клеткинегепатоцитарных рядов, и купроэнзимом. Известно, что в комплексе с ЦПнаходится до 95% от общего количества меди в сыворотке крови крыс (Prohaska,2011). В работе было показано, что удаление надпочечников приводит ксущественному изменению показателей статуса меди в сыворотке крыс.СогласованноеповышениесодержанияполипептидовЦП,уровняего(ферр)оксидазной активности, а также концентрации сывороточной медисвидетельствует о том, что АЭ стимулирует секрецию холо-ЦП. Однако, какпоказывают данные ОТ-ПЦР, АЭ не активирует экспрессию его гена.
Кроме того,в сыворотке крови АЭ крыс было показано присутствие белка МТ, причем у АЭсодержание сывороточного МТ увеличивается. МТ является белком цитозоля, илишь недавно было показано существование его во внеклеточном пространстве(Lynes et al., 2006).В работе было показано, что АЭ приводит к повышению концентрациимеди в органах, для которых характерен интенсивный метаболизм меди – печень,корковый слой почек, гипоталамус. В то же время, в мозговом слое почек, гдеобмен меди происходит на невысоком уровне, содержание меди не изменяется.Возможно, это связано со сроком (в работе исследования проводили на 10 деньпосле АЭ), на котором действует АЭ.
Нельзя исключить, что при болеедлительном воздействии изменения метаболизма меди будут наступать и в другихорганах. Полученное в настоящем исследовании увеличение концентрации меди впечени АЭ крыс полностью согласуются с немногочисленными даннымилитературы (Gregoriadis and Sourkes, 1970; Prohaska et al., 1988; Fields et al.,1991). Для гепатоцитов АЭ крыс характерно внутриклеточное перераспределение117меди. Так, в цитозоле клеток содержание меди увеличивается, а во фракциимитохондрий падает.Исследование показало, что некоторая часть меди, определенной вцитозоле, связана с сывороточным ЦП и, по-видимому, появляется в цитозольнойфракции как результат загрязнения фракции компонентами крови.
Содержаниеполипептидов основного купроэнзима цитозоля СОД1 не изменяется после АЭ,но снижение ферментативной активности данного белка свидетельствует, чтопроисходит снижение отношения холо-СОД1/апо-СОД1. Вероятно, изменениеуровня металлирования СОД1 связано с тем, что осуществляющий данныйпроцессшаперонCCSполучаетмедьвмежмембранномпространствемитохондрий (Leary et al., 2009), и снижение концентрации меди в этихорганеллах приводит к снижению металлирования СОД1. В то же время,увеличивается нагрузка медью белка МТ, выполняющего в цитозоле функциюклеточного депо меди (Palacios et al., 2011; Sutherland and Stillman, 2011), хотясодержание полипептидов данного белка остается на прежнем уровне. Стоиттакже отметить, что в низкомолекулярной фракции цитозоля АЭ крыс, несодержащейбелковоговещества,появляетсянеизвестныйкомпонент,обладающей СОД активностью (способный окислять рибофлавин).
В цитозолеЛО крыс подобный компонент выявлен не был.Характеристика протеома, проведенная в митохондриальной фракциигепатоцитов методом двумерного электрофореза, показала, что в результате АЭпроисходит изменение состава протеома. Для идентификации обнаруженныхизменений требуются дальнейшие исследования.Получение и очистка митохондриальной фракции сочетанием методовдифференциального и ультрацентрифугирования показали, что популяциямитохондрий в гепатоцитах гетерогенна и существующая традиционная методикане позволяет выделить полную популяцию.
Так, существует субпопуляциямитохондрий, седиментирующая с ядерной фракцией. Интересно, что АЭ влияетна состав митохондрий данной субпопуляции, резко снижая отношениесодержания мтДНК/COX4. Одно из наших рабочих предположений состоит в том,118что неоднородность популяции митохондрий обусловлена различием их функцийв клетке. Часть митохондрий участвует в интенсивном клеточном дыхании, в нихв процессе работы электрон-транспортной цепи выделяются токсичные радикалыкислорода, повреждающие липиды внутренней мембраны, белки и мтДНК (StPierre et al., 2002; Brand, 2010). После накопления критического уровнянарушений митохондрии утилизируются макроаутофагией.
Другая группамитохондрий, с низкой интенсивностью клеточного дыхания, что защищает ихмтДНКотповреждения,производитмитохондриидляинтенсивногоэнергетического метаболизма. Основной функцией митохондрий данной группыявляется поддержание пула митохондрий в клетке.По-видимому, описанные изменения обмена меди в печени АЭ крыс неявляются результатом дефицита гормонов надпочечников, так как анализпромоторных областей генов МСМ не выявил цис-элементов, регулируемыхгормонами надпочечников. Кроме того, АЭ не приводит к изменению профиляэкспрессии генов, кодирующих медь-транспортные белки, купроэнзимы, белки,участвующие в депонировании меди, а также белки, ассоциированные сметаболизмом железа, который тесно связан с обменом меди.Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, чтонадпочечники оказывают влияние на поддержание гомеодинамики меди в клеткахпечени.
По-видимому, надпочечники осуществляют регуляцию распределениямеди по клеточным компартментам гепатоцитов и экскреции ее через желчь.Поскольку для изучения механизмов данного процесса необходимо пониматьособенностиметаболизмамедивсамихнадпочечниках,второйэтапдиссертационного исследования был посвящен характеристике метаболизма медив печени и надпочечниках крыс на разных сроках онтогенетического развития.Известно,что втечениеонтогенезараспределение медивтелемлекопитающих заметно изменяется (Mason, 1979).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
