Диссертация (1145769), страница 13
Текст из файла (страница 13)
3.11Б). Включение атомов меди в белок СОД1 происходит при помощи специальногоCu(I)-шаперона CCS. Известно, что апо-CCS получает медь в межмембранном73пространстве митохондрий (Leary et al., 2009). Вероятно, уменьшение содержаниямеди в митохондриях, спровоцированное АЭ, приводит к наблюдаемомуснижению содержания холо-СОД1.Влияние АЭ на содержание цитозольных белков МТ и COMMD1ХроматографическийпикIIIцитозольнойфракциигепатоцитовпредположительно включает МТ, небольшой 10 кДа белок на 30% состоящий изостатков цистеина, что объясняет увеличение поглощение в пике на 254 нм (Рис.3.7).
МТ является участником системы MT-Cu(I)/глутатион/COMMD1-Cu(II),регулирующей количество меди, которое будет запасено в цитозоле, выведено изклетки, либо рекрутировано для последующего встраивания в купроэнзимы(Kang, 2006; Lindeque et al., 2010; Vasak and Meloni, 2011).Для того чтобыоценитьизменения в функционированииданнойрегуляторной системы, вызванные АЭ, был проведен анализ содержанияполипептидов МТ и COMMD1 в общей фракции цитозоля печени ЛО и АЭ крыс.Цитозольнаяфракциябылаполученаметодомдифференциальногоцентрифугирования как супернатант после центрифугирования в течение 1 часапри 23000×g пробы, предварительно очищенной от фракций ядер и митохондрий.Данные, приведенные на рисунке 3.12, показывают, что АЭ не вызываетизменения содержания данных белков в цитозоле гепатоцитов.Известно,чтооднойизважныхфункцийМТявляетсяегофункционирование в качестве внутриклеточного депо меди (Palacios et al., 2011;Sutherland and Stillman, 2011).
Поэтому на следующем этапе исследования былопроведено определение уровня нагрузки МТ медью. Для этого белокиммунопреципитировали из общей фракции цитозоля, после чего в полученныхпреципитатах была определена концентрация меди методом ААС. Результатыпоказывают,чтосодержаниемедибыловышепреципитированной из цитозоля АЭ крыс (Рис. 3.13).вофракцииМТ,74Рис. 3.12. Содержание МТ и COMMD1 в цитозоле печени ЛО и АЭ крыс (n = 3).А – ПААГ после электрофореза в денатурирующих условиях и иммуноблотинга coспецифическими антителами к МТ и COMMD1. Б – денситометрический анализпредставленных выше гелей.Рис.
3.13. Влияние АЭ на содержание меди, ассоциированной с МТ в цитозолепечени крыс (n = 5).* p < 0.05.Таким образом, увеличение содержания общего количества МТ-связанноймеди при неменяющейся концентрации зрелых полипептидов указанного белкасвидетельствует о том, что в результате адреналэктомии увеличивается удельноесодержание атомов меди на молекулу МТ. Этот результат согласуется спредставленными выше данными, показывающими, что в хроматографическихфракциях, соответствующих пику III, из цитозоля печени АЭ крыс наблюдается75подъем содержания меди по сравнению с фракциями соответствующего пикаконтрольных крыс (Рис.
3.8).Хроматографический пик IV из цитозоля АЭ крыс содержит компонент,обладающий СОД активностьюВ IV пике содержание меди было немного выше фонового значения. Крометого, у АЭ крыс в данном пике содержится неизвестный компонент, обладающийСОД активностью, однако у ЛО крыс подобный компонент не обнаружен (Рис.3.10). После проведения ПААГ электрофореза в неденатурирующих условиях,гели были окрашены Кумасси G-250. Однако во фракциях, соответствующих пикуIV, белкового компонента не было обнаружено ни в цитозоле АЭ крыс, ни у ЛОживотных (Рис. 3.13).Рис. 3.14.
Окрашивание хроматографических фракций цитозоля Кумасси G-250после неденатурирующего электрофореза.Фракции, соответствующие пику IV, разделили методом электрофореза вденатурирующих условия, гель окрасили нитратом серебра. Перед нанесением наПААГ пробы обработали ДСН и/или β-меркаптоэтанолом (МЭ) и нагревали при95 °C в течение 5 минут, либо инкубировали при комнатной температуре втечение 5 минут. Результаты показали, что обработка ДСН, МЭ и температурой76приводит к наиболее полной диссоциации взятого в исследование материала (Рис.3.15).Схожая картина наблюдается при исследовании фракции пика IV,полученной из цитозоля печени крысы, получавшей в течение долгого времени спищей хлорид серебра (“Ag крысы”).
Ионы серебра включаются в транспортныепути меди, так как Cu(I) и Ag(I) обладают идентичными координационнымисвойствами в отношении лигандов медь-связывающих мотивов Cu(I)-шаперонов,но серебро, в отличие от Cu(I) не способно изменять степень окисления иэкскретироваться как Cu(II), поэтому его экскреция из гепатоцитов блокирована.Серебро накапливается вначале в митохондриях (Клотченко и др., 2008;Zatulovskiy et al., 2012), а при хроническом поступлении в организм – и в цитозоле(Ileychova et al., 2014)Рис. 3.15. ДСН-электрофорез фракций, соответствующих пику IV, выделенных изпечени АЭ, Ag и ЛО крыс.Денатурирующий электрофорез в 12% ПААГ фракций #53 (АЭ крысы), #40 (Ag крысы) и #35(ЛО крысы), соответствующих пику IV. 1 – пробы обработали ДСН, МЭ и кипятили при 95 °C;2 – пробы обработали ДСН и МЭ; 3 – пробы обработали ДСН и кипятили при 95°C; 4 – пробыобработали ДСН.
Окрашивание геля нитратом серебра.Природа вещества на данный момент не установлена. Можно думать, чтоэто комплекс атомов меди с низкомолекулярными компонентами, возможно,полиглутатион, проявляющий СОД-подобную активность.773.1.4. Исследование митохондриальной фракции гепатоцитов АЭ иконтрольных крысФракции митохондрий печени ЛО и АЭ крыс были изолированыобщепринятым методом дифференциального центрифугирования как осадокпосле центрифугирования при 12000×g в течение 20 минут постъядерногосупернатанта. Разделение фракции митохондрий в ПААГ в денатурирующихусловия и последующий анализ методом иммуноблотинга показали, что врезультате АЭ удельное содержание полипептидов белка COX4 не изменяется(Рис.
3.16).Рис. 3.16. Содержание COX4 в митохондриях печени ЛО и АЭ крыс (n = 3).А – ПААГ после электрофореза в денатурирующих условиях и иммуноблотинга coспецифическими антителами к COX4. Б – денситометрический анализ представленного геля.Анализ протеомов митохондрий печени ЛО и АЭ крысСубклеточные фракции митохондрий и цитозоля были получены изгомогенатов печени крыс методом дифференциального центрифугирования, какописано ранее. Далее, фракции митохондрий были дополнительно очищеныметодом равновесного ультрацентрифугирования с сахарозной подушкой.
Дляэтого каждая фракция была нанесена на раствор сахарозы (42%) и подвергнутаультрацентрифугированию при 58000×g в течение ночи. После этого фракции,78прошедшиечерезгомогенизационнымсахарознуюбуферомподушку,(ГБ)отобрали,иразвелиосвободилив4отразасахарозыцентрифугированием при 15000×g в течение 30 минут. Анализ методом ПЦР соспецифическими праймерами к митохондриальной ДНК (мтДНК) подтвердил, чтоочищенные фракции действительно содержат митохондрии (Рис.
3.17). Расчетныйразмер ПЦР-продукта составляет 518 пар нуклеотидов, однако в результатеанализабылиполученыамплификатыразмеромоколо600п.н.Этонесоответствие можно объяснить тем, что праймеры были подобраны навариабельный участок мтДНК, длина которого варьирует у крыс различныхлиний.Рис. 3.17. Распределение митохондриальной ДНК в полученных фракциях.1 – митохондрии печени ЛО крысы, 2 – митохондрии печени АЭ крысы, 3 – маркеры.Иммуноблотинг фракций с антителами к митохондриальным белкамцитохрому с и COX4 показал, что изолированные фракции обогащены зрелымиспецифическими митохондриальными белками (Рис. 3.18).
При этом в цитозолеприсутствует пре-пептид COX4, а цитохром с обнаруживается лишь в следовыхколичествах. Данные показывают, что полученные фракции митохондрийявляются высокоочищенными.Для того чтобы определить, оказывает ли АЭ влияние на протеоммитохондрийкрыс,митохондриальные фракции,выделенные изпечениконтрольных и АЭ животных, были проанализированы методом двумерногоэлектрофореза (Рис. 3.19).79Рис.
3.18. Анализ чистоты полученной митохондриальной фракции методомиммуноблотинга.Фракции были выделены из печени ЛО (1, 3, 5, 7) и АЭ (2, 4, 6, 8) крыс. 1, 2, 5, 6 –митохондрии; 3, 4, 7, 8 – цитозоль; 9 – коммерческий препарат цитохрома с лошади.Эксперимент был повторен 3 раза. Общая картина распределения белковсоответствует митохондриальному протеому. Кружками выделены участки,демонстрирующие различия протеомов АЭ и ЛО крыс.Рис. 3.19.
Двумерный электрофорез митохондрий печени контрольных(слева) и АЭ (справа) крыс.Изофокусировку проводили в области нелинейного градиента pH 3-11. Денатурирующийэлектрофорез проводили в 12% ПААГ. Гели были окрашены нитратом серебра. Чернымиокружностями обозначены обнаруженные различия протеомов.На электрофореграммах отчетливо выявляются множественные различия.
Вчастности, в области рН 8.5 – 9.0, молекулярный вес 30 – 35 кДа, АЭ крысы80теряют полипептид. В области рН 3.5 – 4.0, молекулярный вес 10 – 13 кДа, вмитохондриях АЭ крыс утрачивается продукт. В области рН 4.0, молекулярныйвес 130 кДа, у АЭ животных появляются три пятна. К тому же, в области рН 7,молекулярный вес около 200 кДа, в мажорной зоне выявляется значительнаяразница, состоящая в конфигурации зоны. В этих опытах мы использовалиобщепринятые способы очистки митохондрий. И хотя нам удалось однозначнопоказать, что АЭ влияет на полипептидный состав митохондрий, сделать болееконкретные заключения не представлялось возможным.
Поэтому мы предпринялипопыткуполучитьочищенныефракциимитохондрий,предполагая,чтомитохондрии в печени крыс неоднородны, и представлены субпопуляциями, и АЭможет изменять соотношения между ними.В предварительном эксперименте гомогенат печени взрослой интактнойкрысы был подвергнут центрифугированию при 800×g в течение 10 минут.Полученный в результате центрифугирования постъядерный супернатант развелив 2 раза ГБ, нанесли на ступенчатый градиент сахарозы (27–42–45–47–50%) ицентрифугировали при 58000×g в течение 5 часов. После центрифугирования вградиенте была видна единая зона, содержащая митохондрии, однако 10 фракцийобъемом по 1 мл были отобраны так, что включали области выше и ниже этойзоны (Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
