Диссертация (1145769), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Послебыстрого (30 секунд) ополаскивания геля в воде гель опускали в растворпроявителя (3% карбоната натрия, 0.05% формальдегида на 0.001% тиосульфатанатрия). Реакцию останавливали переносом геля в 10% уксусную кислоту.Выявление оксидазной активности ЦП в геле методом окрашивания ортодианизидиномДляопределенияоксидазнойактивностиЦПгельпосленеденатурирующего электрофореза инкубировали в растворе орто-дианизидина,59приготовленного на 0.05 М натрий ацетатном буфере, рН 4.5, содержащем 2%этанола.
Инкубацию проводили в течение 2 часов при 37 С, после чего гельсканировали и подвергали денситометрическому анализу (Owen et al., 1961).Выявление ферроксидазной активности ЦП в геле методом окрашиванияферроциномПосле электрофореза в неденатурирующих условиях гель помещали на 2часа при 37 С в свежеприготовленный раствор 0.008 % соли Мора на 100 мМнатрий-ацетатном буфере, рН 5.0. Гель отмывали и в темноте насыщали 15 мМраствором ферроцина, приготовленным на воде, рН 7.0.Активность выявлялась по отсутствию пурпурной окраски в местахлокализации ферроксидаз (Chen et al., 2004). Гель сканировали и проводилиденситометрический анализ.ВыявлениеактивностиСОД1вгелеметодомокрашиваниянитротетразолием синимГель после нативного электрофореза инкубировали 15 минут в 10%растворе нитротетразолия синего на 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7.0.После промывания геля в воде инкубировали еще 15 минут в темноте с раствором100 мМ калий-фосфатного буфера и 10% TEMED.
Добавляли 1% растворрибофлавина, инкубировали в течение еще 15 минут. Гель промывали в воде,реакцию активировали УФ-облучением в течение 5-10 минут до появления полосбелого цвета, соответствующих активности супероксид-дисмутазы (Vives-Bauza etal., 2007). Гель сканировали, проводили денситометрический анализ полученныхданных.ИммунопреципитацияБелок ЦП преципитировали из 50 мкл сыворотки крови инкубацией с 500мкл IgG (1 мг/л), полученными из сыворотки кролика, иммунизированногокрысиным ЦП. Инкубацию проводили в течение ночи при 4 °C с постоянным60перемешиванием.Использованноесоотношениесывороткииантителсоответствует полной и специфической иммунопреципитации (Platonova et al.,2007).Далее смеси центрифугировали при 10000×g в течение 20 минут, осадкидважды промывали PBS, осаждали центрифугированием и растворяли в 400 мклконцентрированной азотной кислоты.Иммунопреципитацию белка МТ проводили в два этапа.
В начале, к 300 мклсыворотки крыс добавили по 5 мкл коммерческих антител к МТ. Смесьинкубировали в течение ночи при 4 °C и постоянном перемешивании. На второмэтапе к смеси добавляли по 170 мкг IgG (1 мг/мл), выделенных из сыворотки осла,иммунизированного кроличьими IgG (вторые антитела) и по 10 мкл кроличьейсыворотки, которую использовали для усиления второго этапа преципитации.После инкубации в течение ночи при 4 °C и постоянном перемешивании, смесицентрифугировали при 10000×g в течение 20 минут, осадки дважды промывалиPBS, осаждали центрифугированием и растворяли в 400 мкл концентрированнойазотной кислоты.Концентрацию общего белка в пробах определяли по методу Брэдфорд(Bradford, 1976).Измерение концентрации металловКонцентрациюметалловопределялиметодоматомно-абсорбционнойспектрометрии (ААС) с электротермической атомизацией и зеемановскойкоррекцией неселективного поглощения на спектрофотометре ZEEnit 650 P.Образцы ткани были гомогенизированы в смеси концентрированных азотной исоляной кислот (1:3 v/v) до полного растворения материала.
Концентрацию медии цинка в образцах сыворотки крови измеряли без предварительной подготовкипробы.Концентрацию натрия и калия измеряли методом пламенной фотометрии напламенном фотометре ПФА-378.612.4.2. Компьютерные методыПо данным литературы были определены последовательности ДНК, черезвзаимодействие с которыми гормоны надпочечников осуществляют регуляциюэкспрессиигенов.Далееизоткрытойон-лайнбазыданныхEnsembl(http://www.ensembl.org/index.html) были получены последовательности длиной3000 оснований выше начала первого экзона генов крысы, кодирующих белки,ассоциированные с метаболизмом меди. После чего в этих промоторных областяхпоискпаттернов,совпадающихсисследуемымирегуляторнымипоследовательностями, был произведен при помощи он-лайн сервиса “RSA-tool”(http://rsat.ulb.ac.be/dna-pattern_form.cgi).2.4.3.
Статистическая обработка результатовДанные представлены в виде “среднее значение ± стандартное отклонение”.Статистическую обработку результатов проводили с применением двустороннегокритерия Стьюдента, а также дисперсионного анализа. Изменения принималистатистически значимыми при уровне значимости p < 0.05.623. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ3.1. Влияние адреналэктомии на метаболизм меди у крысВлияние адреналэктомии (АЭ) на параметры метаболизма меди изучали намолодых половозрелых (3 – 6-месячных) крысах (АЭ крысы).
В качестве группысравненияиспользоваликрыс,перенесшиханалогичнуюхирургическуюпроцедуру, сопровождавшуюся идентификацией, но не удалением надпочечников– ложно-оперированные животные (ЛО крысы). Физиологическое действие АЭконтролировали по изменению отношения концентрации натрия к концентрациикалия в сыворотке крови. У крыс контрольной группы отношение [Na]/[K]соответствовало таковому у интактных крыс (25.5 0.5). У АЭ крыс на 10-ыйдень после операции величина [Na]/[K] снижалась (Рис.
3.1). Наблюдениесоответствует картине, развивающейся вследствие дефицита минералкортикоидови нарушения реабсорбции натрия, и свидетельствует, что изучение метаболизмамеди в печени проводили на фоне изменений, развивающихся при АЭ.Рис. 3.1. Индекс отношения ионов натрия и калия в сыворотке крови крыс (n = 5).*** p < 0.005.3.1.1. Изменения статуса меди в сыворотке крови крыс после АЭВ сыворотках крови животных было проведено определение общепринятыхпоказателей статуса меди: концентрация общей меди, содержание белка ЦП и его63ферментативная активность.
К показателям статуса меди добавлена такжеконцентрация металлотионеина (МТ). В последние годы накапливается всебольше фактов, свидетельствующих о том, что МТ, внутриклеточный белок, генкоторого не содержит последовательностей, обеспечивающих секрецию белкачерез секреторный путь клетки, обнаруживается в сыворотке крови. Причемуровень МТ в сыворотке зависит от таких факторов, как концентрация тяжелыхметаллов в крови и наличие умеренного стресса (Nordberg et al., 1982; Armario etal., 1987; Hidalgo et al., 2001; Bizon and Milnerowicz, 2014). К тому же, МТ,вероятно, участвует в секреции меди и цитокинов путем, не зависимым отаппарата Гольджи (Prudovsky, 2013; Vasak and Meloni., 2011).Так как набор гормонов, производимых надпочечниками, у самцов и самокотличаются, на первом этапе было проверено, отличаются ли показатели статусамеди у АЭ крыс в зависимости от пола.
Различий показателей статуса меди междусамцами и самками выявлено не было (данные не приводятся). В последующем вработе использовали самцов, как пол с более стабильными показателями статусамеди, которые у самок меняются при овуляции, беременности и лактации.АЭ приводит к повышению концентрации меди в сыворотке крови, в товремякаксодержаниецинка,другоговажногомикроэлемента,неассоциированного с метаболизмом меди, остается неизменным (Рис. 3.2).Рис. 3.2. Концентрация меди и цинка в сыворотке крови ЛО и АЭ крыс (n = 5).* p < 0.05.64В сыворотке крови АЭ крыс, по данным ракетного иммуноэлектрофореза,повышается содержание иммунореактивных полипептидов ЦП (Рис.
3.3 А).Относительный уровень оксидазной и ферроксидазной активностей ЦП былопределен в ПААГ с помощью специфического окрашивания соответствующиминебиогенными хромогенными субстратами и последующим денситометрическиманализом.Рис. 3.3. Содержание и ферментативные активности ЦП в сыворотке крови ЛО иАЭ крыс.А – ракетный иммуноэлектрофорез, гель окрашен орто-дианизидином. В качестве стандартаиспользован препарат ЦП крысы в количестве 0.56, 0.28, 0.14 мкг/мкл. Б – кинетика окисленияорто-дианизидина.
Черные линии – ЛО, серые линии – АЭ. В – оксидазная активность в ПААГ(n = 5). Сверху – пример геля, окрашивание орто-дианизидином. Г – ферроксидазнаяактивность в ПААГ (n = 3). Сверху – пример геля, окрашивание ферроцином.* p < 0.05; ** p < 0.01.65Изменение оксидазной активности также было оценено по скоростиферментативного окисления орто-дианизидина, катализируемого препаратамисыворотки крови крыс. Изменение оксидазной активности также было оценено поскоростиферментативногоокисленияорто-дианизидина,катализируемогопрепаратами сыворотки крови крыс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
