Диссертация (1145769), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Показано, что АЭ приводит к повышениюуровня как оксидазной (Рис. 3.3 Б, В), так и ферроксидазной (Рис. 3.3 Г)активности ЦП.Концентрация МТ была определена в сыворотках крови животных методомиммуноблотинга с последующим денситометрическим анализом полученныхрентгеновских пленок. Для проведения данного исследования были использованыпервые антитела, специфически взаимодействующие со всеми формами МТ.Результаты показали, что АЭ приводит к повышению содержания МТ всыворотке крови (Рис. 3.4).Рис.
3.4. Содержание белка МТ в сыворотке крови ЛО и АЭ крыс (n = 5).Сыворотки крови крыс разделяли методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях,после чего методом иммуноблотинга визуализировали зоны, соответствующие белку МТ.* p < 0.05.Из представленных результатов можно сделать вывод, что АЭ приводит ксущественным изменениям показателей статуса меди в сыворотке кровиживотных. Согласованное повышение уровня оксидазной и ферроксидазной66активностей ЦП, а также увеличение концентрации меди свидетельствуют, чтобольшая часть ЦП в сыворотке крови находится в форме холо-фермента.3.1.2. Изменение концентрации меди в органах и субклеточных фракцияхпечени АЭ крысНа следующем этапе работы концентрация меди у АЭ крыс была измерена впечени (орган, определяющий статус меди в сыворотке крови, цель настоящегоисследования) и сопоставлена с таковой для почек и гипоталамуса. Почки быливыбраны потому, что их корковый и мозговой слои отличаются между собойсодержанием митохондриального купроэнзима ЦО, так как в корковом слое нетгликолиза и очень интенсивное дыхание, а в мозговом слое – очень низкийуровеньокислительногофосфорилирования,ноинтенсивныйгликолиз.Следовательно, в корковом слое интенсивность метаболизма меди выше, чем вмозговом слое.
К тому же, у взрослых млекопитающих почки не участвуют вподдержании баланса меди в организме. Гипоталамус был включен в рядисследуемых органов потому, что в нем активен обмен меди из-за высокогоуровнямозго-специфическихкупроэнзимов,участвующихвсинтезенейромедиаторов и процессинге нейропептидов. К тому же, в гипоталамусесинтезируется секреторный ЦП, содержание которого в желудочках мозга выше,чем в спинно-мозговой жидкости, что указывает на участие гипоталамуса вподдержании баланса меди в межклеточном пространстве мозга.Из представленных данных видно, что АЭ приводит к увеличениюконцентрации меди в печени, корковом слое почек и гипоталамусе (Рис.3.5).Полученные в настоящем исследовании данные, показывающие, что в результатеАЭ происходит накопление меди в печени, а в сыворотке крови повышаетсясодержание холо-ЦП, полностью согласуются с немногочисленными даннымилитературы (Gregoriadis and Sourkes, 1970; Prohaska et al., 1988).
Кроме того,Fields с соавторами отмечали, что спустя 6 недель после удаления надпочечникову крыс наблюдается увеличение размеров сердца, при этом масса тела АЭ крысснижалась по сравнению с контрольными животными (Fields et al., 1991).67Известно также, что АЭ оказывает влияние на пролиферацию и дифференцировкусперматогенных клеток в семенниках, вызывая атрофию клеток Лейдига,уменьшение просвета семенных канальцев, нарушение сперматогенеза (Nair et al.,1995). Кроме того, в органах мужской половой системы крысы АЭ приводит кперераспределениюмеди:впридаткахяичкаипредстательнойжелезеконцентрация меди уменьшается, в то время как в семенниках – повышается (Nairet al., 1995; 2001; 2002).Рис. 3.5.
Содержание меди в органах ЛО и АЭ крыс (n = 3).П – печень, КСП – корковый слой почек, МСП – мозговой слой почек, Г – гипоталамус.* p < 0.05.Методомдифференциальногоцентрифугированиябылиполученыследующие субклеточные фракции печени крыс: ядра, митохондрии, фракция,обогащенная мембранами аппарата Гольджи, и цитозоль. Субклеточные фракциипечениЛОкрысбылиподвергнуты20-часовомудиализу.Данные,представленные на рисунке 3.6 А, показывают, что диализ не приводит кснижению концентрации меди в исследуемых фракциях. Следовательно, основнаячасть меди в компартментах ассоциирована с субстанциями, молекулярная массакоторых превышает 800 Да, и находится в недиализуемой форме.Далеебылоизученовнутриклеточноераспределениемедимеждуполученными фракциями органелл печени ЛО и АЭ крыс.
Измерениеконцентрации меди показало, что АЭ приводит к снижению концентрации меди в68митохондриях, в то время как в цитозоле содержание меди увеличивается (Рис.3.6 Б).Рис. 3.6. Концентрация меди в субклеточных фракциях печениЛО и АЭ крыс (n = 3).А – концентрация меди в субклеточных компартментах печени ЛО крыс до и после диализа.
Б –содержание меди в субклеточных фракциях печени ЛО и АЭ крыс. Я – ядра, М – митохондрии,АГ – аппарат Гольджи, Ц – цитозоль.* p < 0.05.3.1.3. Влияние АЭ на распределение меди в цитозоле гепатоцитовДля того чтобы идентифицировать белки, связывающие медь в цитозолегепатоцитов, было проведено разделение цитозоля на фракции методом гельфильтрации на колонке с Сефадексом G75. В каждой фракции было измеренопоглощение при 280 и 254 нм (D280 и D254, соответственно), а также содержаниемеди. Профили D280 совпадали у контрольных и АЭ крыс, поэтому на рисунке 3.7приведены только данные, полученные на контрольных крысах.Материал, поглощающий на 280 нм, элюировался четырьмя пиками:мажорные пики I и II, минорный пик III и пик IV.
Пик III, содержащий белки снизким молекулярным весом, характеризуется увеличением поглощения на 254нм, что свидетельствует о наличии в нем белков, обогащенных цистеином.Поглощение на 254 нм ярко выражено в пике IV, однако материал данного пикатеоретическинедолженсодержатьбелковыхкомпонентов,атольконизкомолекулярные. Поэтому поглощение на 254 нм может быть объясненоприсутствием глутатиона и/или нуклеотидов.69Рис.
3.7. Профиль элюции белков цитозоля клеток печени контрольных крыс.I, II, III и IV – номера пиков. Стрелка указывает на элюцию цитохрома с.Определение концентрации меди во фракциях цитозоля ЛО крыс показало,что большая часть меди соответствует мажорным пикам I и II (Рис. 3.8).Рис. 3.8. Распределение меди по фракциям цитозоля печени ЛО и АЭ крыс.70В цитозоле АЭ крыс также значительная часть меди содержится вофракциях, принадлежащих мажорным пикам, однако значительно увеличиваетсясодержание меди в пиках III и IV.Для молекулярно-весового анализа были выбраны следующие фракции,соответствующие максимальному содержанию меди в пике: #5 (пик I), #13, #14(пик II), #18, #20, #22, #25, #27 (пик III), #35 и #37 (пик IV) из цитозоля печениконтрольных крыс; а также #5 (пик I), #17, #18 (пик II), #24, #27, #30, #31, #32(пик III) и #53 (пик IV) из цитозоля печени АЭ крыс.
Выбранные пробы былифракционированы методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях.После электрофореза белки были визуализированы в геле окрашиванием КумассиG-250, либо гель был окрашен специфическими антителами на ЦП для выявленияприсутствия данного белка в исследуемых фракциях (Рис. 3.9). Видно, что пик Iсодержит основное количество полипептидов, молекулярная масса которыхнаходится в диапазоне 10 – 220 кДа. Пик II включает полипептиды смолекулярной массой 10 – 40 кДа.
Полипептиды пика III по молекулярному весуможно разделить на следующие группы: 10 – 25 кДа (восходящее плечо), 10 – 15кДа (пик) и ≈10 кДа (нисходящее плечо). В пике IV белковый материалобнаружен не был.Рис. 3.9. Молекулярно-весовой анализ белков и содержание ЦП во фракцияхцитозоля печени АЭ крыс.Сверху – окрашивание геля Кумасси G-250. Снизу – иммуноблотинг со специфическимиантителами к ЦП. М – маркеры молекулярных весов.71Выбранные хроматографические фракции цитозоля контрольных и АЭ крысразделили методом ПААГ в неденатурирующих условиях, после чего провелиопределение СОД активности в геле (Рис. 3.10).Рис.
3.10. СОД активность во фракциях цитозоля печени ЛО и АЭ крыс.Основываясь на полученных данных можно предположить, что медь,содержащаяся в пике I, связана с белками сыворотки крови, которые моглипопасть во фракции при гомогенизации образцов печени, загрязненныхфрагментамикровеносныхсосудов.Этопредположениеподтверждаетсярезультатами иммуноблотинга с антителами к ЦП, показавшими присутствиеэтого белка во фракции 5 (Рис. 3.9), а также присутствием СОД активности,зарегистрированной во фракции данного пика (Рис. 3.10). Она соответствуетвнеклеточнойCu/Zn-супероксиддисмутазе(СОД3,молекулярныйвесгомотетрамера – 135 кДа, синтезируется клетками негепатоцитарного ряда).
Впользу данного предположения свидетельствует тот факт, что концентрация медиво фракциях, соответствующих пику I не меняется у АЭ крыс (Рис. 3.8).В соответствии с результатами определения СОД активности в геле, медь изпика II должна быть связана с цитозольным купроэнзимом СОД1 (молекулярныйвес гомодимера – около 32 кДа). Активность СОД в пике II контрольных крысвыше, чем у АЭ животных (Рис. 3.10).Содержание иммунореактивных полипептидов СОД1 и ее ферментативнуюактивность определяли в общей фракции цитозоля, выделенной методомдифференциального центрифугирования. Относительное содержание белка СОД1измеряли методом иммуноблотинга со специфическими антителами.
Оценку72ферментативной активности СОД1 проводили тестированием в геле, она основанана окислении ферментом рибофлавина после электрофореза в неденатурирующихусловиях. Результаты исследования показали, что АЭ не влияет на содержаниеполипептидов СОД1 в цитозоле гепатоцитов (Рис. 3.11). В то же время,активность СОД1 значительно ниже у АЭ крыс по сравнению с контрольнойгруппой, что согласуется с представленными выше данными о снижении СОДактивностииконцентрациимедивхроматографическихфракциях,соответствующих пику II (Рис. 3.8; 3.10).Рис. 3.11. Содержание и активность СОД1 в цитозоле печениЛО и АЭ крыс (n = 3).А – ПААГ, окрашенный специфическими антителами к СОД1 (сверху); ПААГ, окрашенныйнитротетразолием синим для выявления ферментативной активности СОД1 (снизу). Б –денситометрический анализ представленных выше гелей (А) и отношение холо-СОД1/апоСОД1.** p < 0.01.Из представленных данных также видно, что АЭ приводит к резкомупадению соотношения холо-СОД1/апо-СОД1 в цитозоле клеток печени (Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
