Диссертация (1145769), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Сней в промоторе ни у одного из перечисленных генов не обнаружено ни одногополного совпадения. В то же время, найдены последовательности, имеющиеотличие в одном нуклеотиде (Таб. 3.1).Таблица 3.1.Гены, в промоторных районах которых обнаружены CRE-подобныепоследовательностиГенКоординаты CREСовпаденияAtp7a-2725...-2732TGACCTCAAtp7b-2440...-2447TGACGTTACcs-342...-349TGAGGTCACcs-2897...-2904TGAGGTCACox4i1-1946...-1953TGAAGTCACp-1157...-1164TGTCGTCACp-2720...-2727TGACATCASod1-225...-232CGACGTCASod1-772...-779TGAGGTCASod1-1039...-1046TGACTTCA89Также было обнаружено больше ста 8-нуклеотидных последовательностей,отличающихся от канонической на 2 нуклеотида, причем около 40 из нихрасполагались в пределах 1000 нуклеотидов выше кодирующего участка.Как и в случае с CRE последовательностями, полных совпадений сканоническими GRE последовательностями GGTACANNNTGTTCT (Beato, 1989)и AGAACANNNTGTTCT (Umesono and Evans, 1989) обнаружено не было.Небольшое число последовательностей отличались от канонического GREзаменой одного или двух нуклеотидов (> 80% совпадения), но лишь две из нихрасполагалисьвпределах1000нуклеотидоввышекодирующейпоследовательности (Таб.
3.2).Таблица 3.2.Гены, в промоторных районах которых обнаружены GRE-подобныепоследовательностиКаноническаяКоличествоГенКоординатыAtp7a-1285…-1299GGTACANNNTGTTCTGGTACATCCTGTACT1Commd1-767…-781GGTACANNNTGTTCTGGTACAAGATCTTTT2Mt2a-917…-931AGAACANNNTGTTCTAGAACACTACGATCT2Mt2a-1139…-1153AGAACANNNTGTTCTAGGACAGCCTGTCCT2Mt2a-1248…-1262AGAACANNNTGTTCTAGAACAGGATGTTTT1Sod1-1406…-1420AGAACANNNTGTTCTAGAACATGCAGTTTT2-844…-858AGAACANNNTGTTCTAGGACAGCCTGTCCT2-975…-989AGAACANNNTGTTCTAGAACAGGATGTTTA2Mt2a(human)Mt2a(human)последовательностьСовпаденияотличийИнтересно, что промоторная область человеческого гена, кодирующегоMt2a,такжесодержитдванеполныхсовпадениясканоническойпоследовательностью, с отличием в две однонуклеотидные замены каждое (Таб.3.2). Ранее было показано, что экспрессия гена Mt2a человека регулируется90глюкокортикоидами (Karin and Herschman, 1979).
Этот ген был взят врассмотрение по данным проведенного биоинформатического поиска.Исследование транскрипционной активности генов, кодирующих белки МСМ,в печени ЛО и АЭ крысЭкспрессия генов, кодирующих белки, ассоциированные с метаболизмоммеди, была оценена на уровне транскрипции методом полуколичественного ОТПЦР анализа. Результаты исследования показали, что АЭ не приводит кизменению уровней экспрессии генов, кодирующих белки метаболизма меди(Рис. 3.27).Рис. 3.27.
Экспрессия генов, ассоциированных с метаболизмом меди,в печени ЛО и АЭ крыс (n = 5).АЭ не оказывает влияния экспрессию генов, связанных с метаболизмомжелезаМетаболизм меди тесно связан с метаболизмом железа, поэтому внастоящемисследованиибылаоцененаактивностьгенов,кодирующихтранспортеры железа:Fth1 и Ftl, соответственно гены тяжелой и легкой цепей ферритина, белка,исполняющего роль основного внутриклеточного депо железа. Тяжелая цепьферритина содержит ферроксидазный сайт, в то время как легкая цепь отвечает зафолдинг белкового комплекса;91Tf, ген трансферрина, белка плазмы крови, осуществляющего функциюпереноса ионов трехвалентного железа;Tfrc, ген рецептора трансферрина, белка плазматической мембраны,отвечающего за импорт железа в клетку с помощью рецептор-опосредованногоэндоцитоза.Результаты ОТ-ПЦР анализа показывают, что АЭ не изменяет активностьгенов, ассоциированных с метаболизмом железа (Рис.
3.28).Рис. 3.28. Экспрессия генов, кодирующих белки, ассоциированные сметаболизмом железа, в печени ЛО и АЭ крыс (n = 5).В совокупности, полученные в этом разделе данные показывают, что 1) АЭприводит к накоплению меди в цитозоле в составе МТ и в субстанциинеустановленнойприроды; 2)АЭ в митохондрияхвызываетснижениеконцентрации меди, не связанной с ЦО, и изменяет соотношение междусубпопуляциями митохондрий; 3) АЭ снижает уровень металлирования СОД1; 4)протеом митохондрий АЭ крыс отличается от такового у ЛО животных; 5)формирование холо-ЦП в цистернальном пространстве аппарата Гольджиувеличивается.
Ни одно из этих изменений не связано с изменением активностигенов, ассоциированных с метаболизмом меди.923.2. Характеристика метаболизма меди в надпочечникахПредставленные выше данные об изменениях метаболизма меди в печениАЭ крыс свидетельствуют, что между механизмами поддержания гомеостаза медив печени и надпочечниками существует связь. Можно предположить, чтонадпочечникичерезнеизвестныймеханизмвлияютнавнутриклеточноераспределение меди в гепатоцитах и ее экскрецию через желчь. Для того чтобыизучатьфундаментальныеосновыэтогомеханизма,необходимоиметьпредставление о том, как осуществляется метаболизм меди в надпочечниках.Понимание этого механизма представляется важной фундаментальной задачей.Кроме того, необходимо понять, какие изменения претерпевает метаболизм медив надпочечниках на ранних этапах онтогенетического развития. Однако влитературе отсутствуюткакие-либо данные,касающиеся этого вопроса.Исключение составляет работа Fazekas и соавторов, в которой доложен факт, чтов надпочечниках эмбрионов концентрация меди выше, чем у взрослых (Fazekas etal., 1963).Вторая часть диссертационного исследования сосредоточена на выявленииособенностей метаболизма меди в надпочечниках и печени крыс на ранних этапахпостнатального развития.3.2.1.
Концентрация меди в печени и надпочечниках крыс в период раннегопостнатального развитияКонцентрацию меди в печени и надпочечниках определяли у крыс с 1-го по15-ый дни жизни, также концентрация меди была измерена в печени крыс в 1 и 4дни до рождения (Рис. 3.29). Представленные данные демонстрируют, чтопрогрессивное накопление меди в печени крыс начинается в эмбриональномпериоде и продолжается до 12-го дня постнатального развития включительно,после чего концентрация меди резко снижается до уровня, характерного длявзрослых животных.93Рис.
3.29. Изменение содержания меди в печени крыс в период раннегоонтогенетического развития (n = 3).По оси абсцисс: дни жизни до рождения (-4; -1) и после рождения (1-15).Этиданныехорошосогласуютсяссуществующейконцепциейэмбрионального и взрослого типов метаболизма меди в печени крыс. Согласноданному представлению, до 13-го дня жизни в печени крыс сохраняется ЭТММ,который характеризуется накоплением меди в печени. Начиная с 13-го дня жизни,медь перестает аккумулироваться в печени, и начинается ее выведение черезжелчь. Таким образом, происходит переключение на ВТММ (Hurley et al., 1980).Из гепатоцитов крыс на ранних сроках постнатального онтогенеза методомдифференциальногофракции.Далее,центрифугированиябылиполученывнутриклеточныегрубая митохондриальная фракция быларазделена намитохондрии, лизосомы и пероксисомы при помощи ультрацентрифугирования вступенчатом градиенте сахарозы.
Измерение содержания меди в полученныхфракциях показало, что в течение ЭТММ происходит перераспределение медимежду компартментами клеток печени (Рис. 3.30). Так, в течение первых днейжизни, медь аккумулируется в ядрах, но после 5-го дня происходит снижениеконцентрации меди в ядерной фракции. В то же время, содержание меди вмитохондриях увеличивается, достигая максимального значения к концу периодаЭТММ.94Рис. 3.30. Распределение меди в гепатоцитах новорожденных крыс (n = 3).(Данные получены совместно с Платоновой Н.А.
и Самсоновым С.А.)По оси абсцисс: дни жизни после рождения. ЭПР – эндоплазматический ретикулум, АГ –аппарат Гольджи.Сравнение концентрации меди в митохондриях, лизосомах и пероксисомахпоказало, что очищенная фракция митохондрий содержит около 90% меди изгрубоймитохондриальнойфракции.Полученныеданныепозволяютрассматривать митохондрии как органеллу, выполняющую функцию запасаниямеди в течение ЭТММ.
С 5-го по 12-ый дни постнатального развития происходиттакже увеличение содержания меди в цитозоле и фракции внутриклеточныхмембран, причем динамика изменения концентрации меди в этих органеллахпрактически совпадает с таковой для митохондрий (Рис. 3.30). Резкое падениеконцентрации меди во фракциях митохондрий, цитозоля и внутриклеточныхмембран происходит на 13-ый день жизни, в момент переключения на ВТММ.Сведения о механизмах импорта меди в митохондрии и экскреции из нихпрактически отсутствуют. Возможно, импорт меди осуществляется белком Pic2,принадлежащим к семейству митохондриальных переносчиков (Vest et al., 2013).Экскреция меди может происходить при помощи митохондриальной изоформыATP7B, которая образуется в результате посттрансляционной модификации,заключающейся в отрезании фрагмента размером ~20 кДа от N-конца95полноразмерной ATP7B (Lutsenko and Cooper, 1998).
Донором меди для Pic2 имитохондриальной ATP7B может служить эукариотический внутриклеточныйнизкомолекулярный переносчик меди Cu(I), способный перемещаться междумитохондриями и цитозолем (Cobine et al., 2006; Dodani et al., 2011). Возможнотакже, что функцию переносчика меди выполняет 2-кДа белок SCC (small coppercarrier), обнаруженный в сыворотке и моче пациентов на поздних стадиях болезниВильсона (Gray et al., 2012). На данный момент биологический смыслвнутриклеточного перераспределения меди при переключении ЭТММ на ВТММостается неясным.В отличие от печени, снижение содержания меди в надпочечникахначинается сразу после рождения (Рис. 3.31 А). При рождении концентрация медив надпочечниках почти в 50 раз ниже, чем в печени, но уже к 5-му дню жизнипроисходит ее снижение на ~40%, после чего концентрация меди приближается куровню, характерному для взрослых животных.
Надпочечники взрослых крыссодержат 4 – 5 мкг меди на мг ткани, что примерно в 4 – 5 раз ниже, чемконцентрация меди в печени взрослых животных.Рис. 3.31. Изменение концентрации меди в надпочечниках (А) и их массы (Б) укрыс в период раннего онтогенетического развития (n = 3).Сравнение скорости роста надпочечников (Рис. 3.31 Б) и содержания в нихмеди позволяет предположить, что снижение концентрации меди может быть96следствием увеличения массы самих надпочечников, в то время как абсолютноеколичество меди в них остается неизменным.3.2.2.
Статус меди в сыворотке крови крыс в период раннего постнатальногоразвитияВ сыворотках крови новорожденных крыс были измерены следующиепоказателистатусамеди,определяемые метаболизмоммедивпечени:концентрация меди, уровень иммунореактивных полипептидов ЦП, оксидазная иферроксидазная активности ЦП, содержание полипептидов МТ, а такжеколичество атомов меди, ассоциированных с белками ЦП и МТ.Как видно из представленных данных (Рис.
3.32), в сыворотке крови непроисходит увеличения содержания иммунореактивных полипептидов ЦП сразупосле падения уровня меди в печени. Концентрация ЦП, характерная для ВТММ,достигается только к 40-му дню жизни.Рис. 3.32. Содержание меди и ЦП в сыворотке крови крыс на ранних срокахпостнатального онтогенеза.А – Количественный иммуноэлектрофорез сыворотки крови крыс с антителами к ЦП. Гельпосле иммуноэлектрофореза окрашивали орто-дианизидином для выявления оксидазного ЦП.*Сыворотка крови взрослой крысы (180 дней жизни) разбавлена в 2 раза.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
