Диссертация (1145733), страница 15
Текст из файла (страница 15)
minor. Библиотека R1007 была представлена 4 такимифилотипами: одним доминантным и тремя минорными. Первый, относился к хпДНКPedinomonas minor (клон R1007-1), вторые, показали отдаленное родство (90 % и 88 %) спланктомицетами Schlesneria paludicola и B. marina, а также (74 %) с мтДНК N. oceanica.Таким образом, сравнительный анализ двух библиотек 100 метрового горизонта по областямv3-v5 и v4-v8 гена 16S рРНК показал наличие в обеих библиотеках Actinobacteria и хпДНКViridiplantae.
Отдел Viridiplantae был представлен одним и тем же филотипом, тогда какбактериальный филум Actinobacteria двумя разными филотипами. Причем, если отделViridiplantae составлял в каждой библиотеке примерно равный процент от общего числа клонов(R100B – 25 %, R1007 – 30 %), то филум Actinobacteria в библиотеке R100B был представлен на56 %, а в R1007 только на 14 %.Индекс разнообразия Шеннона-Уивера и индекс видового богатства Чао1 для библиотекиR100B составил 1,3 и 8, а для библиотеки R1007 – 1,8 и 11, соответственно (табл. 5; рис. 12). Изэтого следует, что область v4-v8 гена 16S рРНК, оказалась несколько более информативной сточки зрения биоразнообразия, по сравнению с областью v3-v5 того же гена.
В то же времясогласно индексу Гуда - покрытие библиотеки R1007 оказалось несколько хуже (86 %), чем уR100B (92 %).3.5 Анализ микробного разнообразия 200 м горизонта по двум (v3-v5 и v4-v8) областямгена 16S рРНКИзучение микробного разнообразия 200 метрового водного горизонта было проведено путемсоздания двух генных библиотек R200B и R2007 на области v3-v5 и v4-v8 гена 16S рРНК,соответственно (рис. 7). Первоначальный размер выборки для библиотеки R200B составил 41клон. Сравнение полученных последовательностей с БК выявило в общей сложности 12 клонов,относящихся к 6 филотипам-контаминантам.
Таким образом, для библиотеки R200Bокончательная выборка составила 29 клонов, представленных 8 филотипами с покрытием на 86%. Выборка для библиотеки R2007 в начальном варианте составила 39 клонов. Из них с БКсовпало 6 филотипов, тем самым уменьшив размер выборки до 21 клона, представленных 8истинными филотипами с покрытием библиотеки на 81 % (Табл.
5).Идентификация секвенированных клонов из библиотеки R200B, выявила в общей сложности5 бактериальных филотипов, относящихся к филуму Actinobacteria, и 2 эукариотических,принадлежащих к хпДНК Viridiplantae и Dictyochophyceae (Stramenopiles). К доминантным былиотнесены 4 филотипа (клоны 2R-65, 2R-3, 2R-32 и 2R-73) из филума Actinobacteria, составившиев сумме 73 % от общего числа клонов, и один представитель хпДНК Dictyochophyceae (10 % от57всей библиотеки). Отметим, что все 5 филотипов имели 98 % и более сходства с ближайшейпоследовательностью в GenBank. Клоны 2R-65 и 2R-3, относившиеся, первый к acI-AVI кладу(Newton et al., 2007), второй к неопределенному кладу той же acI-A подгруппы, показали 96,5 %и 96,8 % сходства с “Candidatus” P.
limnetica (Jezbera et al., 2009). Клон 2R-73 был идентичен на98,8 % с M. pyrenivorans, тогда как клон 2R-32 показал ближайшее родство на 93,9 % сIlumatobacter fluminis. Единственным представителем эукариот, доминирующим в библиотекеR200B, был клон 2R-8 оказавшийся на 93,5 % сходным с хпДНК Mesopedinella arctica(Dictyochophyceae).Actinobacteria2R-6528%2R-8*10%хпДНК DictyochophyceaeR2007-242%2R-7310%2R-3214%R2007-516%2R-321%β-proteobacteriaминорныеR2007-2321%Рисунок 7. Сравнение доминантных филотипов библиотек R200B и R2007, выявленных в200 метровом горизонте озера Радок, по результатам анализа v3-v5 и v4-v8 областей гена16S рРНК.
Звездочкой обозначены неидентифицированные филотипы.По результатам секвенирования клонов в библиотеке R2007 было обнаружено 7 филотипов,относившихся к трем бактериальным филумам: Actinobacteria (2 филотипа), Proteobacteria (3) иPlanctomycetes(1)иодномуэукариотическомуотделу,представленномухпДНКDictyochophyceae. Из них только 3 филотипа были доминантными: это клоны R2007-2 и R200723 (оба Actinobacteria). Первый показал 98,8 % сходства с M. pyrenivorans, второй,принадлежавший кладу acI-AIV (Newton et al., 2007) был близкородственен на уровне 96,2 % с“Candidatus” P. limnetica (Jezbera et al., 2009). Клон R2007-5, относившийся к филумуProteobacteria, оказался сходным на 98 % с Mesorhizobium loti. Этот филотип был выявлен тольков этой библиотеке и не был обнаружен в других даже в минорных количествах. Отметим, что все3 филотипов имели 98 % и более сходства с ближайшей последовательностью в GenBank.Таким образом, анализ библиотеки R200B (v3-v5) и R2007 (v4-v8) выявил в них 5 и 3доминантных филотипа соответственно.
В микробном составе двух данных библиотексущественно доминировали филотипы филума Actinobacteria. В библиотеке R200B было58выявлено 4 таких филотипа (73 % от общего числа клонов), а в библиотеке R2007 – 2 филотипа(63 % клонов). Также в библиотеке R200B обнаружен филотип родственный (93,5 %) хпДНК M.arctica (Dictyochophyceae, Stramenopiles), тогда как в R2007 – филотип, родственный M. loti.Общими для обеих библиотек оказалась группа филотипов, родственных “Candidatus” P.limnetica, а также клоны 2R-73 и R2007-2, близкородственные M. pyrenivorans.Неидентифицированный филотип был обнаружен только в библиотеке R200B. Им оказалсяминорный филотип 2R-8, принадлежащий хпДНК зеленой водоросли Pedinomonas minor. Крометого, в обеих библиотеках, согласно проведенному анализу, были выявлены один для R200B идва для R2007 HA-филотипа.Статистическийанализданныхпоказал,чтовыборкабиблиотекиR200Bбыларепрезентативна, судя по выходу аналитической кривой на плато и высокому значению индексаГуда (табл.
5, рис. 12). Тогда как выборка библиотеки R2007 оказалась непредставительной, очем свидетельствует наклон кривой и показатель Гуда (81 %), показавший к тому же самыйнизкий процент “покрытия” из всех изученных библиотек. Стоит отметить также, что нарепрезентативность выборки библиотеки R2007, по-видимому, существенно повлияло большоечисло филотипов-контаминантов, составивших примерно половину всей выборки.3.6 Анализ микробного разнообразия нижнего 367 м горизонта по трем (v3-v5, v4-v8,ПГ) областям гена 16S рРНКМикробное разнообразие образца, взятого с глубины 367 м было изучено путем создания трехклоновых библиотек: R367A+B (v3-v5), 37R/31R (v4-v8) и f3R (ПГ) (рис. 8).
БиблиотекаR367A+B была образована с помощью объединения двух независимо созданных библиотек (см.стр. 46). В конечном итоге общее число клонов в обобщенной выборке с вычетом 5 филотиповконтаминантов составило 79 клонов, представленных 15 истинными филотипами. Покрытиебиблиотеки R367A+B было на уровне 92 % (Табл. 5).Созданию библиотеки 37R/31R предшествовал анализ двух библиотек 37R и 31R и ихпоследующее объединение (см.
стр. 49). В общей сложности после удаления из библиотеки37R/31R одного филотипа-контаминанта окончательный объем выборки составил 59 клонов,сгруппированных в 18 филотипов. Покрытие библиотеки составило 93 %.При анализе библиотеки f3R был выявлен один клон-контаминант. Таким образом, выборкасоставила 39 клонов, представленных 11 филотипами. Покрытие библиотеки составило 85 %.59R6-2*4%3R-7*6%R6-1626%R6-20*6%R6-184%R6-85%14%10%31R-85%37R-21*5%37R-2611%31R-17%R6-616%R6-423%26%37R-216%37R-317%31R-237R-79%9%37R-39* 37R-35* 37R-155%5%7%ActinobacteriaCandida division OD1BacteroidetesмтДНКα-proteobacteriaхпДНК Viridiplantaeδ-proteobacteriaхпДНК DictyochophyceaePlanctomycetesминорныеf3R-3510%f3R-8*10%f3R-22*54%Рисунок 8.
Сравнение доминантных филотипов, выявленных в 367 метровом горизонтеозера Радок, по результатам анализа R367A+B, 37R/31R и f3R библиотек. Звездочкойобозначены неидентифицированные филотипы.Идентификация филотипов из библиотеки R367A+B выявила в ней 4 бактериальных филума:Actinobacteria (5 филотипов), Verrucomicrobia (3), Proteobacteria (α (3) и δ (1)), Candida divisionOD1 (2) и одного представителя эукариот (хпДНК Viridiplantae). К доминирующим филумамбыли отнесены Actinobacteria, представленный 4 доминантными филотипами (клоны R6-4, R6-6,R6-8 и R6-16), составившими 70 % от всей библиотеки, а также Proteobacteria (клон R6-18 и R62), Candidate division OD1 (клон 3R-7) и хпДНК Viridiplantae (клон R6-20).
Клоны R6-4 и R6-16принадлежавшие к acI-AVI кладу и неопределенному кладу подгруппы acI-А (Newton et al., 2007)были сходны на ~97 % с “Candidatus” P. limnetica (Jezbera et al., 2009). Клоны R6-6 и R6-8 былиидентичны на 98,8 % с M. pyrenivorans и на 93,9 % с Ilumatobacter fluminis, соответственно.Филотип R6-18 оказался родственным на 97,3 % с Roseomonas frigidaquae. Местоположениеклона 3R-7 внутри филума Candidate division OD1 определить было невозможно и, тем самым,данный филотип был отнесен к так называемой группе лат.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
