Диссертация (1145733), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Выявленные филотипы были проверены по БК ина статус HA-филотипов. В результате число “истинных” филотипов (прошедших все контролина контаминацию) составило 40 из них 20 филотипов были отнесены к доминантным (см.приложение 1). HA-филотипы среди доминантных выявлены не были. Отметим, что совокупнаядоля минорных филотипов (1-2 клона в филотипе), не превышала 25 % от их общего числа вкаждом из водных горизонтов.Оценка клеточных концентраций микроорганизмов в образцах воды с 4-х глубин показала ихсодержание в ранге (1,6 – 2,4) х 104 кл/мл, что на порядок ниже, чем в соседнем эпишельфовымозере Бивер (Laybourn-Parry et al., 2006) и говорит о сравнительно низкой биомассе. В то времякак в подледниковом озере Восток число клеток составляет 0 – 24 кл/мл (Bulat et al., 2009)3.1 Сравнение двух библиотек 367А и 367В нижнего горизонта по области v3-v5(1)Обе библиотеки были созданы на основе двух водных образцов, отобранных с глубины 367 мпутем секвенирования v3-v5 области генов 16S рРНК.
Первоначальный объем выборки длябиблиотеки R367A составил 47 клонов, а для R367B – 41 клон. После сопоставленияреферентных последовательностей с БК в первой выборке были обнаружены 2, а во второй 3филотипа-контаминанта. Тем самым, окончательный размер выборки для библиотеки R367Aсоставил 44 клона, а для R367B – 35 клонов (Табл.
2; Рис. 3).Сравнительный анализ двух экспериментальных библиотек (2 независимых выделения ДНК)показал, что все филумы были общими, кроме класса δ-proteobacteria, представленнымфилотипом (R6-2) отдаленно родственным (83 % сходства) Desulfomicrobium hypogeium ивыявленным только в библиотеке R367A. Библиотеки R367A и R367B были представлена 3филумами и 1 отделом. В обеих библиотеках явным численным превосходством обладалифилотипы филума Actinobacteria, составившие в сумме 63 % в R367B и 77 % в R367A,соответственно.
При этом, если библиотека R367A была представлена 5 ОТЕ, то R367B только 3ОТЕ, которые оказались общими для обеих библиотек.47Таблица 2. Сравнение двух библиотек 367А и 367В нижнего горизонта водного столба пообласти v3-v5.Ближайший вид из GenBankПрокариотыActinobacteriaCandidatus Planktophila limnetica (FJ428831.1)Клад acI-AVIКлад acI-AIVНеопределенный клад acI-A подгруппыMycobacterium pyrenivorans (NR 028970)Ilumatobacter fluminis (NR_041633)α-proteobacteriaRoseomonas frigidaquae (NR_044455.1)Roseomonas frigidaquae (NR_044455.1)Ketogulonicigenium vulgare (AF136848)δ-proteobacteriaDesulfomicrobium hypogeium (AF132738)Candidate division OD1Uncult.
bact. (FJ482182)Uncult. bact. (AY922093)VerrucomicrobiaPedosphaera parvula (AY960777)Prosthecobacter vanneervenii (NR_026022)Chthoniobacter flavus (AY388649)ЭукариотыViridiplantae, зелёные водоросли (хпДНК)Pedinomonas minor (FJ968740)Сходство,%Клоновые библиотеки,v3-v5367A367B96,596,297,498,593,9361(16)2(1)5(2)25(11)9(4)97,995,697,75(2)2(1)2(1)83*7 (3)95,8*90,9*2(1)6(2)51(18)6(2)3(1)14(5)6 (2)3(1)86*91,496,52(1)88*2 (1)11 (4)- процент клонов в библиотеке.В скобках – число клонов* - неидентифицированный филотипСерым фоном выделены общие филотипы для обеих библиотек.1Из них 2 ОТЕ (R6-4/3R-1 и R6-16/3R-16) принадлежали, первая к acI-АVI кладу (от англ.
clade),вторая к неопределенному кладу той же acI-А линии пресноводных Actinobacteria (Newton et al.,2007)), близкородственных на уровне ~97,0 % с “Candidatus” P. limnetica (Jezbera et al., 2009)).Третий общий филотип (R6-6/3R-41) показал близкое родство (98,9 % сходства) с Mycobacteriumpyrenivorans. Помимо этих трех актинобактериальных филотипов общими для библиотек такжебыли клоны R6-18 и 3R-4 родственные на 98 % Roseomonas frigidaquae и клоны R6-20 и 3R-12сходные на 88 % хлоропластной ДНК (хпДНК) зеленой водоросли Pedinomonas minor.В итоге, из общего числа филотипов (12 для R367A и 8 для R367B) только 5 былипредставлены в обеих библиотеках.
Статистические данные (табл. 4) показывают, что выборкабиблиотеки R367B была репрезентативна, судя по индексу Гуда (94 % покрытия) и выходуаналитической кривой на плато (рис. 12), а также соответствию показателя математическогоожидания числа филотипов индекса Чао1 с количеством ОТЕ в выборке.483R-12*11%R6-2*Actinobacteria3R-19R6-493R-33*α-proteobacteriaR6-437%R6-183R-1651%3R-7*14%δ-proteobacteriaR6-89%VerrucomicrobiaCandidate division OD1R6-625%3R-4R6-30R6-163R-41хпДНК Viridiplantae3R-1367A367B* неидентифицированные филотипыРисунок 3.
Сравнение клоновых библиотек 367А и 367В, созданных путем секвенированияобластей v3-v5 генов 16S рРНК.В то время как выборка библиотеки R367A оказалась недостаточно представительной. Такимобразом, благодаря тому, что проба А была взята ближе к осадкам, чем проба В, библиотекаR367A показала большее разнообразие.В итоге, обе библиотеки были объединены, а общее число клонов и филотипов библиотекиR367A/B составило 88 и 15, соответственно.(1)Образец воды был взят пробоотборником Kemmerer объемом 1,2 л и длиной 47 см. При отборе пробы в нижнюючасть пробоотборника попала вода, расположенная ближе к осадкам (проба А), тогда как верхняя часть былазаполнена более высоким слоем воды (проба В).3.2 Сравнение двух экспериментальных библиотек 31R и 37R нижнего горизонта пообласти v4-v8Для амплификации v4-v8 участка генов 16S рРНК были использованы общий «прямой»праймер и два незначительно различающихся «обратных» праймера, практически одногоразмера, но со сдвигом по последовательности ДНК на 4 буквы (на 3’ конце).
Необходимо быловыяснить, какая из двух комбинаций праймеров более эффективна в плане вскрытия микробногоразнообразия.Объем выборки для библиотеки 37R составил 40 клонов, в то время как для 31R – 20 клонов.После сравнения полученных ОТЕ с БК в библиотеке 37R был выявлен только один минорныйфилотип-контаминант, а также один НА-филотип, а в библиотеке 31R – ни одного. Таким49образом, окончательный размер выборки для 37R составил 37 клонов, объединенных в 14филотипов, тогда как для 31R – 20 клонов и всего 5 филотипов (Табл. 3; Рис. 4).Таблица 3. Сравнение доминантных и минорных филотипов нижнего горизонта водногостолба по области v4-v8 по двум праймерным системамБлижайший вид из GenBankПрокариотыActinobacteriaCandidatus Planktophila limnetica (FJ428831.1)Клад acI-AVIКлад acI-AIVMycobacterium pyrenivorans (NR 028970)α-proteobacteriaRoseomonas frigidaquae (NR_044455.1)Rhodovarius lipocyclicus (NR_025629)BacteroidetesChitinophaga sancti (AB078068)Sediminibacterium salmoneum (NR_044197)Flavobacterium frigidarium (NR_117853)Adhaeribacter aquaticus (NR_042235)PlanctomycetesAlgisphaera agarilytica (AB845176)Algisphaera agarilytica (AB845176)Algisphaera agarilytica (AB845176)VerrucomicrobiaOpitutus terrae (AJ229246)ЭукариотыViridiplantae, зелёные водорослиPedinomonas minor (FJ968740) хпДНКMychonastes huancayensi (GQ477050) 18S рРНКStramenopilesXanthophyta, жёлто-зелёные водоросли (мтДНК)Nannochloropsis oceanica (KC568462)Dictyochophyceae (хпДНК)Mesopedinella arctica (AY702158)Сходство,%96,596,298,8Клоновые библиотеки,v4-v831R37R351(7)97,394,195,499,097,887*5(2)11(4)16(6)8(3)14(5)25(5)20(4)5(2)3(1)85*83,8*82,9*11(4)3(1)3(1)93,35(2)88*99,65 (1)15(3)74*8(3)93,58(3)- процент клонов в библиотеке.В скобках – число клонов* - неидентифицированный филотипСерым фоном выделены общие филотипы для обеих библиотек.1Сравнительный анализ н.п.
показал, что в библиотеке 31R было выявлено 2 бактериальныхфилума и 1 эукариотический отдел, тогда как в библиотеке 37R – 4 и 2 соответственно, изкоторых Actinobacteria и Bacteroidetes присутствовали в обеих библиотеках. На уровнефилотипов общей оказалась только одна последовательность (клоны 31R-9/37R-2), относящаясяк acI-AVI кладу пресноводных Actinobacteria и сходная на 96,5 % с “Candidatus” P. limnetica.Статистический анализ показал, что обе библиотеки достаточно репрезентативны, судя повыходу аналитических кривых на плато, а также по величине показателя Гуда. Индекс видового50богатства Чао1 в обоих случаях равнялся числу филотипов в каждой библиотеке (Табл. 4; Рис.12).37R-39*37R-2Actinobacteria31R-837R-2131R-6*31R-935%α-proteobacteria37R-3111%37R-2737R-12*Bacteroidetes37R-2616%37R-36*PlanctomycetesVerrucomicrobia37R-35*11%31R-120%хпДНК Dictyochophyceae37R-1537R-6*37R-3431R-225%37R-714%мтДНКхпДНК Viridiplantae37R31R* неидентифицированные филотипыРисунок 4.
Сравнение клоновых библиотек 31R и 37R, созданных путем секвенированияобластей v4-v8 генов 16S рРНК.Таким образом, сравнение двух данных библиотек показывает важность дизайна праймеровдля ПЦР, когда «сдвиг» праймера на 4 буквы на 3’-конце кардинально меняет «картину»выявляемого микробного разнообразия (как по числу выявленных филотипов, так и по ихвидовой принадлежности).
В итоге, для дальнейшей работы был выбран обратный праймер1397mR. Впоследствии, обе библиотеки были объединены, а общее число клонов и филотиповбиблиотеки 37R / 31R составило 59 и 18, соответственно.Таблица 4. Статистические данные для 4-х экспериментальных клоновых библиотекГлубинаОбразецОбласть гена 16S рРНКЧисло клонов/флотиповЧисло “истинных”клонов/филотиповИндекс Чао1Индекс Шенонна-УивераИндекс Гуда,%Водный стоб367 мR367B31RR367Av3-v537Rv4-v848/1540/1020/540/1544/1235/820/539/1417(12,8-40,9)1,9(1,6-2,2)868,3(8,0-12,8)1,5(1,2-1,9)945(н.д.)1,5(1,2-1,7)9514,6(14,0-21,1)2,5(2,3-2,7)92513.3 Анализ микробного разнообразия верхнего горизонта по трем (v3-v5, v4-v8, ПГ)областям гена 16S рРНКДля определения микробного разнообразия верхнего горизонта были созданы три клоновыебиблиотеки: R1B – по области v3-v5, 17R - область v4-v8 и f1R – полноразмерный ген (ПГ) (Рис.5).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
